纳米硒对热应激虹鳟血清抗氧化指标和免疫指标的影响

卢军浩，李兰兰，权金强，赵桂研，孙 军，林桥荣，刘 哲

(甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

虹鳟(Oncorhynchusmykiss)属鲑科大麻哈鱼属，适宜生长水温为12～18 ℃，是一种典型的冷水性鱼类[1]。然而，全球变暖使我国虹鳟养殖业一直在遭受夏季高温的威胁，很容易造成减产或大面积死亡[2]。有研究表明，网箱养殖模式下，22 ℃的水温已经对虹鳟产生了不利影响，24 ℃已经达到了虹鳟耐受的临界点，水温高于25 ℃虹鳟会开始逐渐死亡[3]。因此，在高温来临前，提升虹鳟机体抗氧化和免疫能力具有重要生产实践意义。热应激会导致细胞内蛋白质变性，错误折叠率升高[4]。活性氧(ROS)是细胞正常的代谢产物，当机体受到持续热应激时，ROS含量会大幅增加，ROS积累会产生大量的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，破坏细胞器的正常结构，导致炎症反应，释放大量血清肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)等炎症因子[5]。动物机体具有一套完整的酶类抗氧化体系，其中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)等抗氧化酶在清除ROS、缓解机体氧化受损方面发挥着重要作用[6]，免疫球蛋白和补体系统也参与了机体的抗氧化防御，保障机体的免疫健康[7-8]。纳米硒属单质硒，粒径在80 nm内，具有高表面-体积比，有高活性、低毒性的特点，在免疫和抗氧化防御方面发挥着重要作用[9-10]。Rotruck等[11]研究发现，硒是GSH-Px的活性中心；
史孟娟[12]发现，相比于同浓度的亚硒酸钠和硒代蛋氨酸，纳米硒具有更低的毒性；
Yu等[13]发现，饲料中添加纳米硒能显著提高低氧胁迫下草鱼(Ctenopharyngodonidella)GSH-Px活性，降低MDA含量；
Dawood等[14]发现，日粮中添加纳米硒能显著提高尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)抗氧化酶活性和肝脏、脾脏中TNF-α和IL-1β基因表达量；
李彦红等[15]发现，添加纳米硒能提高齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)生长性能、肌肉硒含量和血清抗氧化指标。通过膳食补充纳米硒缓解鱼类氧化应激已经成为一种有效的方法，但关于纳米硒在虹鳟抗热应激上的研究鲜有报道。

本研究以纳米硒为饲料添加剂，测定虹鳟在摄入纳米硒后血清抗氧化指标和免疫指标的变化，旨在探讨纳米硒在虹鳟抗热应激上的机制，为抗热应激饲料的研发提供理论基础。

1.1 试验材料

选取遗传背景一致、体格健康、平均体质量约80 g的8月龄虹鳟600尾。虹鳟饲料选用北京汉业科技有限公司市售虹鳟稚鱼配合饲料(主要原料：鱼粉、豆粕、小麦粉、磷酸二氢钙、玉米蛋白粉、谷朊粉、啤酒酵母粉、鱼油、复合维生素、复合微量元素等；
饲料成分：粗蛋白质≥48%，粗脂肪≥10%，粗纤维≤5%，粗灰分≤14%，水分≤12%，赖氨酸≥2.6%，总磷≥0.9%)。纳米硒由广州市博士奥生化技术研究有限公司提供，纳米硒浓度为0.5%，粒径80%集中在60～80 nm，由武汉百仟度生物科技有限公司测定。以羧甲基纤维素钠(CMC)为增稠剂，每千克饲料中添加5 g，与水按1∶30的比例溶解纳米硒，制备纳米硒含量为5，10 mg/kg的虹鳟饲料，对照组饲料只加入增稠剂，不添加纳米硒，自然条件下晾干，4 ℃冷藏保存，分别抽样采用国标法测定饲料中硒元素浓度，结果见表1。

表1 饲料中硒元素含量测定Tab.1 Determination results of selenium content in feed mg/kg

1.2 试验方法

挑选体格大小一致的虹鳟600尾随机分为3组，每组200尾，饲养在3个室内循环流水养殖槽(6 000 L)中，微流水养殖。(18.0±0.2)℃暂养7 d后进入试验期，对照组继续饲喂基础日粮，处理组饲喂纳米硒含量分别为5，10 mg/kg的日粮，继续在(18.0±0.2)℃饲喂9 d。第9天结束后，使用冷暖水机和加热棒使水温在30 min升至(24.0±0.2)℃并维持，热应激处理48 h。分别在热应激前(18 ℃)0，3，6，9 d和热应激后(24 ℃)4，8，12，24，48 h 每个时间点每组随机取10尾鱼，快速转入MS-222(50 mg/L)深度麻醉后用一次性医用注射器(2 mL)尾静脉采血，将血液置于4 ℃冰箱静置2 h，于4 ℃、3 500 r/min离心10 min制备血清，收集血清并置于-20 ℃冰箱保存备用。暂养期和试验期内每天投喂试验饲料3次，时间为8：00，12：00，18：00，日投喂量为鱼体质量的3%，投喂完成30 min后观察并记录摄食情况，然后用虹吸管吸取残饵和粪便，并在8：30，12：30，18：30测量溶氧量、氨氮浓度，试验期间保持光照12 h/黑暗12 h。试验期间保持溶氧量(9.0±0.5)mg/L，氨氮浓度(0.10±0.05)mg/L，pH值7.5±0.2，亚硝酸盐浓度(0.01±0.001)mg/L。水温利用深圳市安晟电子有限公司生产的数显温度计(CX-WDJ200LCD)测定，溶氧、pH值、亚硝酸盐和氨氮浓度利用杭州陆恒生物有限公司检测试剂盒测定。

1.3 指标测定

按照白蛋白(Albumin，ALB)试剂盒、总蛋白(Total protein，TP)试剂盒操作说明书测定血清中ALB和TP含量，球蛋白(GLO)含量=TP含量-ALB含量。按照谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒操作说明测定GSH-Px、SOD、CAT、MDA指标。按照鱼类免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)Elisa试剂盒、鱼补体蛋白3(C3)ELISA试剂盒、鱼白介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒、鱼肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒操作说明，采用酶联免疫法(ELISA)测定IgM、C3、IL-1β、TNF-α指标。测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，其中吸光度值用酶标仪(AWARENESS Stat Fax 2100，美国)测定。

1.4 数据处理

2.1 纳米硒对热应激下虹鳟血清蛋白的影响

纳米硒对热应激下虹鳟血清蛋白含量的影响见图1，热应激前，饲喂9 d，处理组TP含量显著高于对照组(P<0.05)。热应激降低了TP的含量，热应激后3个试验组的TP含量均呈现先上升后降低的趋势，对照组和5 mg/kg纳米硒组在24 h达到最高，10 mg/kg纳米硒组在12 h达到最高，且5 mg/kg纳米硒组TP含量显著高于其他组(P<0.05)(图1-A)。

不同小写字母表示同一时间点下不同处理组间酶活性差异显著(P<0.05)。图2，3同。Different lowercase letters indicate significant difference of enzyme activity between different treatment groups at the same time(P<0.05).The same as Fig.2，3.

添加纳米硒提高了虹鳟血清ALB的含量，饲喂6，9 d，10 mg/kg纳米硒组ALB含量显著高于5 mg/kg纳米硒组和对照组(P<0.05)。热应激降低了ALB的含量，热应激后添加纳米硒组ALB含量逐渐上升，对照组ALB含量则是先上升后趋于稳定。热应激24 h，5 mg/kg纳米硒组ALB含量显著高于其他组(P<0.05)，10 mg/kg纳米硒组与对照组无显著差异(P>0.05)，热应激48 h，5 mg/kg和10 mg/kg纳米硒组ALB含量显著高于对照组(P<0.05)(图1-B)。

热应激前，饲喂9 d添加5 mg/kg纳米硒组球蛋白(Globulin，GLB)含量显著高于其他组，10 mg/kg纳米硒组GLB含量低于对照组，差异显著(P<0.05)。热应激降低了GLB的含量，热应激后3个试验组均呈现先上升后降低的趋势，5 mg/kg纳米硒组在8 h达到最大值，10 mg/kg纳米硒组在12 h达到最大值，对照组则在24 h达到最大值。热应激后，除48 h外，其他时间点添加纳米硒组GLB含量显著高于对照组(P<0.05)(图1-C)。

2.2 纳米硒对热应激下虹鳟血清抗氧化酶的影响

纳米硒对热应激下虹鳟血清抗氧化酶的影响见图2，热应激前，3个试验组的GSH-Px含量均呈现先降低后升高的趋势，饲喂9 d，添加纳米硒组GSH-Px含量显著高于对照组(P<0.05)。热应激降低了GSH-Px的含量，热应激后，对照组GSH-Px活性呈现先上升后保持稳定趋势；
5 mg/kg纳米硒组GSH-Px活性呈现逐渐上升的趋势，在4，48 h显著高于其他组(P<0.05)；
10 mg/kg纳米硒组GSH-Px活性呈现先上升后下降的趋势，在24 h达到最大值，在8，12，24 h显著高于其他组(P<0.05)(图2-A)。

图2 纳米硒对热应激下虹鳟血清抗氧化酶的影响(n=10)Fig.2 Effects of nano-selenium on antioxidant enzymes in serum of rainbow trout under heat stress(n=10)

热应激前，在饲喂第9天，10 mg/kg纳米硒组SOD含量显著高于其他组(P<0.05)。热应激降低了SOD的含量，热应激后5 mg/kg纳米硒组SOD活性呈现逐渐上升的趋势，在4，24，48 h显著高于其他组(P<0.05)；
10 mg/kg纳米硒组SOD含量呈现先上升后下降的趋势，且在12 h达到最大值，显著高于其他组(P<0.05)；
对照组SOD含量也呈现先上升后下降的趋势，在12 h达到最大值(图2-B)。

热应激前，饲喂6，9 d，添加纳米硒显著提高了血清CAT的含量(P<0.05)。热应激提高了血清CAT的含量，热应激后，对照组CAT的含量呈现先上升后趋于稳定的趋势，添加纳米硒组CAT含量呈现先上升后下降的趋势，且均在12 h达到最大值，显著高于对照组(P<0.05)(图2-C)。

热应激前，3个试验组血清MDA含量均无显著变化。热应激使MDA含量升高。热应激后，对照组MDA含量呈现先上升后下降再上升的趋势，而纳米硒添加组在热应激后均呈现先上升后下降的趋势。5 mg/kg纳米硒组MDA含量在热应激4，8，24，48 h显著低于其他组(P<0.05)，12 h相对对照组显著升高(P<0.05)；
10 mg/kg纳米硒组MDA含量在热应激4，8，12，48 h显著低于对照组(P<0.05)，在24 h与对照组无显著差异(P>0.05)(图2-D)。

2.3 纳米硒对热应激下虹鳟血清免疫酶的影响

纳米硒对热应激下虹鳟血清相关免疫酶的影响见图3，热应激前，添加纳米硒对血清TNF-α含量无显著影响。热应激后5 mg/kg纳米硒组TNF-α含量呈现先上升后下降的趋势，10 mg/kg纳米硒组和对照组均呈现先下降后上升的趋势。热应激4 h，5 mg/kg纳米硒组TNF-α含量相比对照组升高，10 mg/kg纳米硒组相比对照组降低，且差异显著(P<0.05)；
热应激12 h，5 mg/kg纳米硒组TNF-α含量相比对照组无显著差异，10 mg/kg纳米硒组相比对照组升高，且差异显著(P<0.05)(图3-A)。

热应激前，添加纳米硒对血清IL-1β含量无显著影响。热应激后5 mg/kg纳米硒组IL-1β含量呈现先上升后下降的趋势，10 mg/kg纳米硒组呈现逐渐上升的趋势，对照组则呈现先下降后上升的趋势。5 mg/kg纳米硒组和10 mg/kg纳米硒组IL-1β含量在热应激4 h相比对照组显著升高 (P<0.05)；
热应激12 h，比对照组显著降低(P<0.05)(图3-B)。

热应激前，添加纳米硒对血清IgM含量无显著影响。热应激后3个试验组IgM含量呈现先下降后上升的趋势。热应激4 h，5 mg/kg纳米硒组IgM含量显著高于其他2组(P<0.05)；
热应激12 h，10 mg/kg纳米硒组IgM含量显著高于其他2组 (P<0.05)(图3-C)。

热应激前，饲喂第9 天，添加纳米硒提高了血清C3含量，差异显著(P<0.05)。热应激后3个试验组C3含量呈现下降趋势，添加纳米硒显著提高了血清C3含量。热应激4，12 h，5 mg/kg纳米硒组IgM含量显著高于其他2组，差异显著(P<0.05)(图3-D)。

图3 纳米硒对热应激下虹鳟血清免疫相关酶的影响(n=10)Fig.3 Effects of nano-selenium on immune related enzymes in rainbow trout serum under heat stress(n=10)

血清中的TP由ALB和GLB组成[16]。ALB是血浆渗透调节的载体，在改善细胞膜方面具有关键作用，GLB能修复机体组织，紧急情况下能作为能源物质给机体功能[17]。ALB和GLB的水平通常用于评估鱼类的免疫水平，低水平的ALB和GLB会干扰正常蛋白质的合成[18]。本研究发现，热应激4 h，虹鳟血清TP含量显著下降，可能是急性热应激下，大量ALB和GLB产生了糖异生，分解为游离氨基酸作为能源物质给机体供能[19]；
也可能是急性热应激下ALB用来修复细胞膜的损伤。夏斌鹏等[2]研究发现，慢性热应激下虹鳟血清TP、ALB和GLB含量升高，但差异不显著，这可能与热应激的方式有关。随着热应激的持续，血清中ALB含量呈现逐渐上升的趋势，TP和GLB的含量呈现先上升后下降的趋势，说明持续热应激激活了血清蛋白分泌的信号通路。Harsij等[20]研究发现，饲料中添加纳米硒能提高氨胁迫下虹鳟血清中ALB和GLB的含量，这与本研究结果一致，可能是由于纳米硒在通过氨基酸转运机制主动吸收后，转化为硒半胱氨酸，继而合成硒蛋白，提高机体免疫力[21]。

GSH-Px是重要的抗氧化酶之一，其主要组成成分之一是硒代半胱氨酸[22]。本研究发现，热应激前期虹鳟血清GSH-Px活性降低，这与Shokraneh等[19]在肉鸡胚胎发育中的研究结果相似，随着热应激的持续，GSH-Px活性逐渐上升，推测热应激短时间内使机体产生了大量ROS，急剧增加了GSH-Px的消耗，其机制是GSH-Px通过将氢过氧化物还原为相应的醇，阻止活性氧自由基产生，从而起到保护机体生物大分子和生物膜抗氧化作用[23]。在本研究中，热应激下添加纳米硒显著提高了虹鳟血清中GSH-Px的活性，这与在罗非鱼、草鱼[13-14]上的研究相同，其机制可能是GSH-Px的表达依赖于硒的摄取，纳米硒促进了硒代半胱氨酸的合成，而硒代半胱氨酸正是GSH-Px的重要组成成分之一[9]。

MDA是细胞内脂质过氧化的敏感标志物，是ROS短时间内积累过多，脂质发生过氧化反应而产生的有毒物质[5]。MDA引起蛋白质和核酸等大分子交联聚合，也是细胞受损程度的指标[22]。研究发现，日粮中添加纳米硒降低了罗非鱼[14]、齐口裂腹鱼[15]、草鱼[13]血清中MDA活性。Harsij等[20]发现，添加纳米硒能降低氨胁迫下虹鳟血清MDA含量，这与本研究结果一致，证明纳米硒通过提高机体抗氧化酶活性，清除过量ROS，减少MDA的产生。此外，5 mg/kg纳米硒组MDA含量在热应激12 h突然升高，可以解释为此阶段细胞内脂质过氧化速率大于抗氧化酶的分解速率，导致ROS一定程度的短暂积累，引起MDA的短暂升高，与之相对应的是，在热应激48 h，添加纳米硒组MDA出现显著下降的趋势，这可能是热应激后期抗氧化酶大量分泌，抗氧化酶的分解速率大于ROS的产生速率。此外，5 mg/kg纳米硒组MDA的活性普遍低于10 mg/kg纳米硒组，再一次说明过量的纳米硒对机体的促氧化作用。

TNF-α与IL-1β为细胞炎症因子。TNF-α主要由淋巴细胞和巨噬细胞分泌，能够激活巨噬细胞与中性粒细胞，促进抗原活化和T、B淋巴细胞增殖分化；
IL-1β形成于免疫反应早期，在机体的免疫应激中发挥着重要作用[28]。但也有些研究认为，TNF-α与IL-1β细胞因子的增加是机体产生有害影响的原因[5]。IL-1β与TNF-α等细胞因子的表达和分泌受核转录因子kappa B(NF-kB)信号通路的调控，热应激可以诱导机体发生氧化应激，细胞中过量生成的ROS能够作为信号分子激活NF-kB通路，这是机体前期细胞因子大量分泌的原因[29]。王红权等[28]发现，在草鱼日粮中添加0.2%的牛膝多糖能提高血清中TNF-α含量，提高机体的特异性免疫。但是随着其分泌量的增加，表示机体炎症反应加剧，Sheiha等[5]发现，热应激提高了兔血清中IL-1β含量，添加纳米硒则能有效降低炎症细胞因子，这与本试验结果一致。纳米硒则可能通过调控热休克蛋白、促进抗氧化酶合成等途径间接调控NF-kB信号通路，促进和抑制下游IL-1β与TNF-α细胞因子的释放[30]。

免疫球蛋白IgM是由2条轻链和2条相同的重链构成的多肽链结构，分为恒定区和可变区，其中重链恒定区在免疫过程中起着多种效应作用[31]。Choi等[32]研究发现，硒能提高鲫鱼(Carassiusauratus)IgM的产生和表达，提高机体的免疫力。本研究发现，热应激4 h，3个组的IgM含量均下降，推测由于IgM具有抗感染作用，参与了细胞的炎症反应，修复受损细胞[33]。热应激12 h，3个组的IgM含量均上升，表明此时机体相关免疫信号通路激活，调控分泌IgM，且添加纳米硒组的IgM活性显著高于对照组，推测硒也可能是IgM合成的重要元素，或硒蛋白与IgM分泌相关的信号通路存在关联，通过促进IgM分泌而提高机体免疫能力。

C3是补体系统的主要成员之一，是具有酶原活性的球蛋白，其水平是衡量体液免疫的重要指标[34]。刘波[35]研究发现，热应激1 h团头鲂(Megalobramaamblycephala)血清中C3浓度显著降低。陈星灿等[36]发现，添加硒化多糖和亚硒酸钠能显著提高黑鲷幼鱼体内C3的含量。本研究中，热应激使虹鳟血清中C3的含量呈现逐渐下降的趋势，日粮中添加纳米硒显著提高了C3的含量。C3是补体系统中的最关键成分，处于补体经典、凝集素和旁路3条激活途径的汇聚点上，参与了溶血、融菌与炎症反应等调控过程，C3含量的下降说明机体正在发生抗氧化反应，而纳米硒促进了C3的合成，这种促进可能是纳米硒直接参与了补体蛋白的合成，或者是纳米硒合成半胱氨酸，硒蛋白对C3的合成具有调控作用，诱导合成的C3进一步激活补体系统，通过免疫复合物和调理吞噬细胞等机制对机体发挥免疫调节等功能，提高虹鳟的免疫能力[8，34]。

饲粮中添加纳米硒能提高急性热应激下虹鳟血清TP、ALB和GLB等血清蛋白含量，提高GSH-Px、SOD、CAT等抗氧化酶活性，降低MDA含量，提高TNF-α、IL-1β、IgM和C3等免疫酶的活性。纳米硒通过合成硒蛋白、促进抗氧化酶的分泌，提高细胞因子水平、促进免疫球蛋白分泌和增强补体系统综合调控虹鳟机体抗氧化和免疫系统，进而提高虹鳟抗氧化能力和免疫能力，且添加5 mg/kg纳米硒对机体的保护能力更强，其最适添加量有待进一步研究。本研究结果为揭示纳米硒对热应激下虹鳟抗氧化机制的影响提供了理论基础，为虹鳟抗热应激饲料的研发提供了参考。