斑马鱼早期胚胎发育过程中IL-1β表达的特点*

赵砚驰， 李化， 李丹， 杨雁竹， 杨晓凤， 黄江涛， 莫大双， 舒莉萍*

(贵州医科大学 基础医学院 免疫学教研室，细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室， 贵州省再生医学重点实验室， 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室， 贵州 贵阳 550004；

中国医学科学院 成体干细胞转化研究重点实验室， 贵州 贵阳 550004)

20世纪40年代在研究发热的机制过程中，研究人员发现激活的白细胞可以释放一种诱导发热的因子，将其命名为白细胞介素1(interleukin 1，IL-1)[1]，可分为IL-1α与IL-1β，其中IL-1β由巨噬细胞、内皮细胞、T淋巴细胞(T-lymphocyte，TL)及B淋巴细胞(B-lymphocyte，BL)等分泌并作用于其他细胞发挥促炎效应，是炎症免疫反应发生和发展的重要调控因子[2-3]。IL-1β可通过自分泌与旁分泌的方式刺激T细胞活化和B细胞的分化，还能促进单核细胞、巨噬细胞等抗原呈递功能[4]。有研究发现IL-1β是核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路的下游效应因子，是炎症的重要生物标志物[5]。IL-1β能通过血液循环到达全身，作用于下丘脑发挥致热效应以及刺激下丘脑-垂体释放糖皮质激素，进而针对IL-1β发挥负反馈调节作用[6]。随着对IL-1β的深入研究，发现IL-1β除了参与免疫调节功能，还参与造血、内分泌及神经系统等多种病理生理过程[7]；
IL-1β在哺乳类动物胚胎发育中同样起着重要作用，与胚胎数量及胚胎形态呈正相关关系，小鼠体内使用IL-1受体拮抗剂可以阻断胚胎的顺利着床[8]；
IL-1β可通过调控胚胎发育的质量影响妊娠的情况，如检测培养液中的IL-1β可评估胚胎发育的潜能与质量[9-11]。研究在小鼠、兔子等动物模型中探索IL-1β的功能，但是由于小鼠、兔子等动物模型的饲养成本高昂、繁殖周期较长以及胚胎为宫内发育等特点，无法高通量高效且清晰直观的探究IL-1β在动物体内的变化情况[12-13]。新型模式生物斑马鱼具有体型小、繁殖能力强、体外受精且胚胎透明、易于基因编辑等优势，尤其是其全基因组测序工作已经完成，发现其具有与人类高度保守的发育与疾病基因[14-16]，然而尚未查到有斑马鱼早期胚胎发育过程中IL-1β表达情况的研究，因此本研究将斑马鱼中IL-1β氨基酸序列与人类等9个不同物种IL-1β氨基酸序列进行同源性分析，并在斑马鱼胚胎早期发育过程中探究IL-1β的表达特点，为IL-1β相关疾病的研究提供实验与理论基础。

1.1 实验材料

1.1.1动物来源 选用野生型斑马鱼4 ～ 72 受精后小时(hourspost-fertilization，hpf )的胚胎，该品系名称为Tüebingen，属于本实验室自行繁殖培育，合格证号为[ SYXK(黔)2018-0001 ]。

1.1.2细胞及主要试剂 大肠杆菌(Escherichiacoil，E.coli)DH5α感受态细胞、Taq 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)预混液、质粒小提试剂盒(北京天根生化)，First Strand 互补脱氧核糖核酸(complementary DNA, cDNA)Synthesis Kit、限制性内切酶NotⅠ和限制性内切酶EcoRⅠ、T4 DNA连接酶(美国ThermoFisher)，pGEM-T载体(pGEM-TVector)、T3聚合酶(T3 RNA Polymerase，美国Promega)，DIG RNA Labeling Mix(德国Roche)，原位杂交染色试剂盒BCIP/NBT(美国Vector Lab)；
TRIzol Reagent(美国ambion)，ProbeQuantTMG-50 Micro Columns(英国cytiva)。

1.1.3主要仪器 分子杂交箱HL-2000(美国UVP)，PCR仪etc811(北京东胜创新)，高速冷冻离心机(安徽中科中佳)，体视显微镜SMZ25(日本尼康)。

1.2 实验方法

1.2.1斑马鱼养殖 野生型斑马鱼(Tüebingen品系)于室温(26±2)℃且12 h/12 h照明的循环水系统中养殖，斑马鱼胚胎培养于培养液(0.06 g/L海盐、0.5mg/L亚甲基蓝)中。

1.2.2斑马鱼IL-1β基因氨基酸同源性分析及系统进化树绘制 在美国国家生物信息技术中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的数据库中查询IL-1β在人类、斑马鱼、猪、绵羊、水牛、小鼠、大鼠、家兔以及豚尾猴的氨基酸序列，通过多重序列比对软件(multiple sequence alignment，DNAMAN)进行氨基酸序列的相似性比对，最后通过分子进化遗传分析软件(molecular evolutionary genetics analysis X，MEGA X)制作系统进化树，选用算法Neighbor-joining进行评估。

1.2.3斑马鱼总RNA提取及cDNA合成 分别收集4组72 hpf斑马鱼胚胎(25枚/组)，TRIzol处理、氯仿抽提、异丙醇沉淀，所得产物用75%乙醇洗涤，加适量焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解；
将上述总RNA进行逆转录得到cDNA，-20 ℃保存。

1.2.4地高辛标记的IL-1β反义信使RNA(messenger RNA，mRNA)探针制备 根据斑马鱼IL-1β基因序列使用Snap Gene软件设计引物：F端为TGAGAAAGCAGAGGAACTTAACC，R端为AATTAACCCTCACTAAAGGGCGAATCTTCATACGCGGTG(划线位置表示添加的T3启动子序列)。使用T4DNA连接酶将NotⅠ与EcoRⅠ双酶切后的pGEM-T载体产物与同样限制性内切酶双酶切的IL-1β片段产物进行质粒重组，琼脂糖凝胶电泳与测序鉴定无误后，利用EcoRⅠ将pGEM-T-IL-1β线性化，使用T3转录体系进行体外转录，纯化所得产物后得到反义mRNA探针，置于-80 ℃冻存。

1.2.5斑马鱼全胚胎原位杂交 分别收集4、6、9、12、18、24、48及72 hpf的斑马鱼胚胎，25枚/组。利用4%多聚甲醛(paraformaldehyde fixative solution，PFA)固定胚胎过夜，甲醇梯度脱水，-20 ℃保存；
复水，蛋白酶K处理48 hpf和72 hpf胚胎，其余时间的胚胎无需蛋白酶K处理；
所有样本胚胎于分子杂交箱中68 ℃预杂交4 h；
加地高辛标记的IL-1β反义mRNA探针杂交14 h；
第2天柠檬酸钠(saline sodium citrate，SSC)缓冲液洗涤，加抗地高辛碱性磷酸酶抗体(antisense digoxigenin alkaline phosphatase，anti-DIG-AP；
1 ∶5 000)于4 ℃孵育16 h；
第3天含Tween-20的马来酸缓冲液(maleic acid buffer-tween，MABT)洗涤，加新鲜配置的BCIP/NBT染液，避光染色直至阳性杂交信号出现，立即使用PBST洗涤终止染色，4% PFA固定，于体视显微镜下进行观察。

2.1 不同物种间IL-1β的生物信息学特征

通过对人类、斑马鱼、小鼠、家兔及猪等9个物种的IL-1β氨基酸序列进行相似性比对，结果显示斑马鱼IL-1β氨基酸序列与人类、小鼠、家兔以及猪等9个物种相似度较高(图1)；
后续绘制9个物种的IL-1β系统进化树(图2)，结果表明在斑马鱼进化过程中与哺乳类动物具有一定保守性。

2.2 pGEM-T- IL-1β重组质粒构建及鉴定结果

使用氨苄抗性筛选的pGEM-T-IL-1β重组质粒经过限制性内切酶双酶切后，将双酶切鉴定结果正确的产物进行测序鉴定，将测序结果与已知斑马鱼IL-1β基因序列比对，结果保持一致。见图3和图4。

2.3 野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中IL-1β基因的表达

全胚胎原位杂交实验结果表明，4 hpf野生型斑马鱼胚胎中开始观察到IL-1β阳性杂交信号表达；
6～12 hpf野生型斑马鱼胚胎可见IL-1β广泛表达的阳性杂交信号，12 hpf胚胎中表达尤为明显；
18 hpf野生型斑马鱼胚胎躯干背侧、眼睛以及胚胎中后部的中间细胞群(intermediate cell mass, ICM)等部位观察到不同程度的IL-1β阳性杂交信号表达；
24 hpf野生型斑马鱼胚胎整胚中可见IL-1β表达，头部、眼睛及心脏部位观察到强杂交信号；
48～72 hpf野生型斑马鱼胚胎躯干部位的肌肉组织中IL-1β表达尤为明显。见图5。

注：英文字母表示不同氨基酸序列，数字表示氨基酸序列号，*表示相同氨基酸序列，.或∶表示不同相似程度的氨基酸序列；
-表示该物种与其余物种对比缺失的氨基酸序列片段。图1 不同物种间IL-1β氨基酸序列的比对Fig.1 Alignment of IL-1β amino acid sequences from multiple species

注：结点上方数字为自展值，表示该进化分支的可信度。图2 不同物种间IL-1β的进化树Fig.2 Phylogenetic tree of IL-1β in multiple species

注：M为DNA Marker Ⅲ，1～4分别为重组质粒pGEM-T- IL-1β。图3 pGEM-T- IL-1β重组质粒EcoRⅠ与NotⅠ双酶切产物电泳鉴定结果Fig.3 Electrophoresis result of pGEM-T-IL-1β recombinant plasmid digested with EcoRⅠ and NotⅠ enzyme

注：红色方框表示所选取限制性内切酶及碱基序列，黑色箭头表示所指限制性内切酶位点；
红色曲线表示胸腺嘧啶，绿色曲线表示腺嘌呤，蓝色曲线表示胞嘧啶，黑色曲线表示鸟嘌呤。图4 pGEM-T-IL-1β重组质粒测序结果Fig.4 Sequencing result of pGEM-T-IL-1β recombinant plasmid

注：黑色箭头表示IL-1β表达最为突出部位。图5 野生型斑马鱼胚胎发育过程中不同时间点IL-1β的表达(全胚胎原位杂交，×80)Fig.5 Expression of IL-1β during embryonic development of wild-type zebrafish at different time (The whole embryo in situ hybridization,×80)

IL-1β是近年来研究受到热烈关注的细胞因子之一，当其与相应受体结合后可在信息传递以及激活调节免疫细胞等方面发挥作用，可以刺激机体组织产生炎症以及防御反应[17-19]。例如可导致NF-κB经典信号通路被激活，IκB蛋白降解后使得二聚体得到释放，使得p65磷酸化激活进入细胞核调控基因转录[20-21]；
IL-1β还能通过激活p38以及JNK信号通路，促进细胞的增殖[21-22]。早期有研究发现在小鼠胚胎不同发育阶段中，检测到IL-1β在4细胞期、8细胞期及囊胚中出现mRNA水平表达，此外还有研究发现IL-1β蛋白在胚胎所有阶段均有表达，并且伴随着胚胎成熟蛋白表达逐渐增加[23]。

本研究生物信息学分析结果表明，斑马鱼IL-1β氨基酸序列与人类IL-1β氨基酸序列相似度较高，从而提示了斑马鱼IL-1β与人类IL-1β功能相似，并在进化过程中斑马鱼与哺乳类动物保守性较高；
通过成功构建pGEM-T-IL-1β重组质粒，制备地高辛标记的IL-1β反义mRNA探针进行全胚胎原位杂交实验结果显示，IL-1β在4 hpf斑马鱼胚胎中观察到阳性杂交信号，12 hpf胚胎中广泛表达，18 hpf胚胎躯干背侧以及眼睛等部位表达外、在中后部的ICM中同样观察到IL-1β的阳性杂交信号。由于ICM是斑马鱼胚胎发育过程中原始造血发生的重要区域之一，相当于哺乳类动物胚胎中的卵黄囊，含有大量原始造血细胞，ICM中的后部造血岛位于尾部腹侧区，标志着原始造血的结束[24-25]，因此结果提示IL-1β可能与胚胎早期造血发育密切相关。24、48及72 hpf时，IL-1β表达逐渐从斑马鱼胚胎头部延伸至全身躯干，几乎在所有细胞中表达，其中在肌肉组织中表达尤为明显，提示IL-1β可能是斑马鱼早期胚胎发育的重要因子。

近年来模式动物已被作为研究和解释基因功能的手段，被广泛用于相关疾病模型研究，而斑马鱼在基因上的高度保守性，使其弥补了非脊椎动物与哺乳类动物之间的“空隙”，以及疾病建模技术的发展，例如可以采用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)与吗啉代反义寡核苷酸(morpholino, MO)等技术的出现，使得利用斑马鱼建立疾病模型方法更为成熟[26]。本研究通过分析斑马鱼胚胎早期发育中不同时期IL-1βmRNA的表达情况，有助于在相关疾病的斑马鱼模型中更好地探索IL-1β的功能和作用。

综上所述，本研究不仅通过生物信息学分析了斑马鱼IL-1β氨基酸序列在进化过程中具有相对保守性，并且通过全胚胎原位杂交实验发现IL-1β的表达贯穿斑马鱼早期胚胎发育过程，提示IL-1β可能在斑马鱼早期胚胎发育中起着重要作用，为进一步探索IL-1β在相关疾病中的作用提供了实验基础。