三黄颗粒对α-萘异硫氰酸酯诱导胆汁淤积大鼠肝损伤保护作用的研究

赵 薇，赵庆春

(北部战区总医院药剂科·辽宁 沈阳 110000)

三黄颗粒，是根据中国传统验方“茵陈蒿汤”加减化裁而来，具有清利湿热退黄功效，主要用于孕妇预防胎儿及新生儿溶血症[1]。于本院经临床应用多年，深受广大医患的欢迎，临床疗效极佳。本科课题组经过多年研究，对三黄颗粒的质量标准、体外活性成分等进行了分析[2]，但其预防新生儿溶血的药理作用尚不清楚，此前有学者认为，肝功能尚未发育完全或新生儿自身对于胆红素代谢存在一定障碍时，具有免疫调节的T细胞呈现了负反馈调节[3-4]，胆红素不能发挥其抗氧化作用，导致多器官功能甚至结构性损伤,表现为新生儿面目黄染，查血可见诸多肝功能指标下降, 甚至会导致新生儿肝脏纤维化和肝硬化。在中医学中，婴肝征属于湿热型黄疸，是综合性疾病，脾虚为主或外感疫毒肝胆运化失控，习称“黄疸”[5]。本课题组探讨三黄颗粒保护肝损伤的作用机制。

1.1 实验动物 SPF级SD系2周龄(相当于人幼儿期)大鼠72只，体质量(40±30) g,♀♂兼半，由北部战区总医院实验动物中心提供，动物实验许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2 实验药物 三黄颗粒：北部战区总医院，产品批号：20190505，主要成分为：茵陈、大黄、黄芩、黄柏、甘草，生药浓度4、6、8 g/kg；
熊去氧胆酸胶囊：德国福克大药厂，批号：L19091A，规格：250 mg /粒，配制药物浓度5 g /L。

1.3 实验试剂 α-萘异硫氰酸酯(ANIT)：成都艾科达化学试剂有限公司，批号：
201910251；
丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒：德国罗氏；
碱性磷酸酶酶(ALP)、总胆红素(TNiL)、直接胆红素(DBiL)、间接胆红素(IBiL)、总胆汁酸(TBA)测定试剂盒：九强生物技术股份有限公司；
肝脏组织层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、透明质酸酶(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)检测试剂盒：天津原子能公司。

1.4 实验仪器 Cobas C8000全自动生化分析仪：罗氏；
UV-1700紫外分光光度计：
日本岛津公司；
TD5A台式多管架离心机：长沙英泰仪器有限公司；
生物电子显微镜：OLYMPUS；
D7100照相机：尼康；
FA2004电子分析天平：上海天平仪器厂。

2.1 模型制备及分组处理 将72只SD大鼠随机分为6 组，正常对照组、模型组、阳性对照组和三黄颗粒低、中、高剂量组，每组12只。除正常组外，其余各组均给予ANIT葵花籽油(20 g/L,0.6 mL/100 g)灌胃造模[6-8]，隔日1 次，连续用药4周；
正常组灌胃等量生理盐水。给予ANIT灌胃3 次后，阳性组给予熊去氧胆酸(0.3 mg/100 g)灌胃，每天1次，三黄颗粒低、中、高剂量组给予不同浓度三黄颗粒溶液(4、6、8 g/kg)灌胃，每天1次；
均给药4周；
模型组、正常组给予等量生理盐水灌胃，每天1次，直至4周。

2.2 观察指标

2.2.1 血清AST、ALT、 ALP、TBIL、 IBIL、DBIL、TBA检测 末次给药后禁食水12 h,各组大鼠腹主动脉取血(取血前乙醚适度麻醉)，每只大鼠取血约3 mL，经3 000 r/min离心10 min，吸上清，-20℃保存备用。全自动生化分析仪测定大鼠血清AST、ALT、 ALP、TBIL、 IBIL、DBIL、TBA。

2.2.2 肝组织纤维化指标检测 大鼠采血后立即断脊法处死大鼠，取肝脏,经低温盐水水洗后剪取1 cm×1 cm×1 cm大小的组织块；
用乙二胺四乙酸二钠(0.01 mol/L)、三氨基甲烷Tris-HCL缓冲液(0.1 mmol/L)、pH7.4灭菌蒸馏水、0.8%氯化钠溶液、0.01 mmol/L的蔗糖制备匀浆介质；
将肝组织放入匀浆介质中，低温高速离心,取上清液，采用放射免疫法,检测LN、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C值。

2.2.3 肝组织病理学观察 选取肝中叶组织1 cm×2 cm×0.3 cm，石蜡包埋，切片机切片5μm，苏木-伊红染色，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

3.1 各组大鼠血清AST、ALT、ALP、TBA、TBIL、IBIL、DBIL比较 见表1。

表1 各组大鼠血清AST、ALT、ALP、TBA、TBIL、IBIL、DBIL水平比较

3.2 各组大鼠肝组织纤维化指标比较 见表2。

表2 各组大鼠肝组织纤维化指标比较

3.3 各组大鼠肝组织病理变化 正常对照组和阳性对照组：肝脏外观轮廓、颜色正常(粉褐色，状态饱满, 边缘锐利, 质地柔软,分叶清晰)；
显微镜下见肝脏组织结构完整,肝窦及肝小叶外观形态正常,肝细胞均匀分布，核大而圆，核膜清晰，胞质丰富，排列整齐有序。模型组：肝脏外观肿胀，形态不规则，分布不均匀，边缘圆钝,略显灰白色；
显微镜下可见肝小叶轮廓不清，胆管增生，点片状坏死，汇管区、肝小叶间可见管周围水肿，胆小管胆汁淤积，肝窦间、肝窦中炎症细胞较正常组和阳性对照组明显增多，肝细胞空泡，明显嗜酸性病变坏死。高剂量组：细胞形态规则，结构完整，可见轻度黄染；
低剂量组：可见轻度黄染，肝脏小叶坏死少见,间隙增宽；
高剂量和低剂量组可见纤维组织增生、炎症细胞浸润程度较模型组轻，小叶间胆管大致正常未见胆汁淤积。中剂量组与正常组极为相似，镜检见肝小叶间隙略有增宽，纤维组织增生不明显。见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理学观察(HE，×40)

正常人肝功能完备时，可将体内胆汁经胆道运输，最终随粪便排出体外，但新生儿肝脏发育不完全、病理性损伤或ABO溶血症导滞肝细胞发生病变肿胀、肝小胆管管腔闭塞，形成胆汁淤积，过多的胆红素不能顺利地排出体外，最终形成各种胆汁淤积性疾病，临床表现为新生儿黄疸。ANIT是肝毒性物质，作用于肝细胞和胆管上皮细胞[9]，可诱发大鼠胆汁淤积性肝损伤，病理状态及临床表现与人类胆汁淤积性黄疸相似[10]。本研究中,大鼠造模后出现肛周、眼角黄染，排尿金黄色，造模大鼠血清生化指标AST、 ALT、TBIL、DBIL、IBIL、ALP、TBA及肝组织匀浆肝纤维化指标LN、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C值明显高于正常组，说明造模成功。

三黄颗粒加减化裁于《伤寒论》的茵陈蒿汤，由茵陈、大黄、甘草等5 味中药组成，方中君药茵陈，主入肝经，有良好的利胆退黄功效[11]，其主要成分绿原酸是一种挥发油，可以促进胆汁分泌；
大黄为泻下药之要药，其主要成分大黄酸和大黄素，通过泻下作用阻碍胆红素经过肝肠循环，从而降低胆红素的吸收率。全方使湿热疫毒从二便去从而使黄疸消退[12]。临床广泛应用于黄疸的治疗，作为院内制剂应用多年，功效清利湿热退黄，对于孕妇预防胎儿及新生儿溶血症具有显著疗效。

ALT与AST广泛分布于肝细胞内，对于肝细胞受损有着很高的敏感性[13]，临床上是常用的肝功能指标。ALP是诊断胆道系统疾病常用的指标；
TBIL也是判断黄疸程度的主要指标；
ALP为一种含锌的蛋白，为膜性结合酶，几乎存在于机体的各个组织，主要分布于肝细胞的血窦侧和毛细血管侧的微绒毛上，正常情况下血清中的ALP经血液到肝脏，经胆道排泄，胆汁排出不顺畅致毛细胆管压亢进时，ALP明显升高[14-16]。

三黄颗粒高、中、低剂量组大鼠血清AST、 ALT、ALP、TBIL、DBIL、IBIL、TBA均较造模组降低；
说明三黄颗粒具有利胆退黄作用，能够改善病理黄疽大鼠的肝脏损伤。高、中、低剂量组组间相比较，大鼠血AST、 ALT、ALP、TBIL、DBIL、IBIL、TBA值表现出明显差异，中剂量组所得结果与正常对照组无明显差异。模型组肝脏纤维化指标LA、HA、PC-Ⅲ、Ⅳ-C 值均有升高，高、中、低剂量组LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C值低于模型组，而高、中、低剂量组之间也存在差异，肝脏形态改善明显；
均说明三黄颗粒能够改善大鼠胆汁淤积所导致的肝脏损伤，改善肝脏纤维化程度。

本文实验结果表明：三黄颗粒具有利胆退黄的作用，中等剂量疗效较好，同时可减轻黄疸性疾病引起的肝脏病理损伤,减轻肝纤维化。