广西地区不同饲养模式及不同季节水牛奶霉菌毒素污染状况调查

唐庆凤，李 玲，黄加祥，方文远，农皓如，唐 艳，陆呈委，韦盘秋，冯 玲

(1.中国农业科学院广西水牛研究所，南宁 530001；
2.广西壮族自治区水牛乳质量与安全控制技术工程研究中心，南宁 530001；
3.广西大学动物科学技术学院，南宁 530005)

近年来国内外牛奶质量安全问题频发，牛奶中霉菌毒素的污染严重威胁着消费者的健康[1-3]。霉菌毒素是由曲霉、镰刀菌和青霉等丝状真菌产生的次级代谢产物，在牛奶、奶制品、谷类饲料等农畜产品中广泛存在[4]。霉菌毒素对动物及人体具有致癌性、肾脏毒性、肝脏毒性、雌激素样作用、遗传毒性、免疫抑制、生殖障碍及刺激皮肤等效应[5]。中国谷物霉菌毒素污染现象较为严重，污染率达90%以上[6-7]。奶牛采食霉菌毒素污染的饲料后，在牛奶中可检测到相应霉菌毒素和代谢产物[8]。郑楠等[9]报道，霉菌毒素在牛奶中常见的种类为饲料中原毒素及其经过牛体的代谢产物，将牛奶中常见的霉菌毒素按照风险指标重要程度依次排序为黄曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)、T-2毒素(T-2)、HT-2毒素(HT-2)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和伏马菌素(FB)。国内外学者均报道了水牛奶也存在霉菌毒素污染问题[10-12]。因此，研究广西地区水牛奶的霉菌毒素污染状况，保障广西地区安全生产水牛奶，对广西地区乃至全国的水牛奶产业发展意义重大。

以往研究主要针对水牛奶中AFM1的污染情况进行调查[12]，而少有同时检测水牛奶中AFM1及HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON、OTA的报道。虽然近年来规模化养殖是乳用水牛产业发展的方向，但广西区乳用水牛养殖仍以散养为主，且养殖合作社或养殖小区饲养模式也占有一定的比例。在以往的研究中，很少有学者探究规模化养殖、养殖合作社或养殖小区、农户散养这3种饲养模式水牛奶中霉菌毒物污染的水平。另外，广西位于中国华南地区，位于北纬20°54′―26°24′、东经104°28′―112°04′之间，南临热带海洋，北接南岭山地，西延云贵高原，属亚热带季风气候区[13]，由于受季风影响，广西降水量季节分配不均，干湿季分明，在春季的3―4月时降雨频繁，易出现回南天，回南天出现时，空气湿度接近饱和，饲料原料易产生霉菌毒素，从而易引起水牛奶霉菌毒素污染。秋季(9―11月)是干季，干燥少雨，如2020年秋季总降水量仅占全年降水量的18.36%[14]，饲料原料不易产生霉菌毒素，从而有利于降低水牛奶中霉菌毒素污染风险。因此，本研究在2020年10―11月(秋季，干燥气候)和2021年4月(春季，回南天)以广西地区乳用水牛规模化养殖场(存栏50头以上)、养殖合作社或养殖小区、乳用水牛养殖户(散养)的秋季和春季原料水牛奶样品为研究对象，检测水牛奶霉菌毒素的污染水平，追踪水牛奶中霉菌毒素污染的季节变化，了解不同饲养模式及季节对水牛奶质量安全的影响，从而为水牛奶安全生产与消费提供参考。

1.1 样品采集

在2020年10―11月和2021年4月，选取广西地区乳用水牛主产区南宁市、钦北防、玉林等地采集水牛奶样品。其中，每季规模化(存栏50头以上)、养殖合作社或养殖小区、散养各饲养模式随机采集原料水牛奶样品8个，每季24个样品，共计48个样品，每个样品取450 mL，样品采集分布情况见表1。奶样采集有奶罐和奶桶2种方式：奶罐采样：采样前将奶罐中的生鲜乳缓慢搅动后分别从奶罐的上、中和下部1/3处分别取生鲜乳样品150 mL，混合成450 mL奶样[15]；
奶桶采样：将奶摇匀，随机取样450 mL。奶样采集分装后，立即放入干冰中，然后转移至―20 ℃保存备用。

表1 样品分布情况

1.2 主要试剂及仪器

AFM1试剂盒购自北京美正生物科技有限公司；
HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON和OTA试剂盒均购自南京森贝伽生物科技有限公司。主要仪器有：酶标仪(Bio-Rad iMark 12708，伯乐公司)；
生化培养箱(SHP-150，上海精宏实验设备有限公司)；
FOSS多功能乳品分析仪(FT-120，福斯公司)。

1.3 霉菌毒素测定

按照ELISA试剂盒说明书检测水牛奶中AFM1、HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON和OTA的含量。

1.4 牛奶中霉菌毒素限量

AFM1已被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物质，OTA被列为Ⅱ类致癌物质[16]，但全球目前仅对牛奶中AFM1制定了限量标准，少部分国家对OTA进行了限量，对于其他霉菌毒素只制定了每日最大容许摄入量(provisional maximum tolerable daily intake，PMTDI)等相关制度，具体情况见表2。

表2 水牛奶中霉菌毒素限量

续表

1.5 数据处理

试验数据用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，Duncan氏法进行组间多重比较。结果用平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著。

2.1 广西地区不同饲养模式下水牛奶霉菌毒素的污染状况

2.1.1 水牛奶中AFM1的污染状况 由表3可知，各饲养模式生产的原料水牛奶中AFM1含量均无显著差异(P>0.05)。在48个样品中有16个检出AFM1，检出率为33.33%。其中，养殖合作社或养殖小区模式检出率最高，为43.75%；
散养模式最低，为18.75%。全部样品的AFM1含量均低于中国限量标准0.5 μg/kg，但散养和规模化模式各有1个样品，共计2个样品(4.17%)超过欧盟限量标准0.05 μg/kg，散养模式样品的平均含量高于其他2个饲养模式。

表3 不同饲养模式生产的原料水牛奶中AFM1含量

2.1.2 水牛奶中其他霉菌毒素的污染状况 由表4可知，各饲养模式生产的原料水牛奶中HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN和DON的成人PMTDI值都远远低于JECFA设定值，OTA的成人PTWI值也均低于JECFA设定值，且OTA的含量均低于欧盟限量标准(<2 ng/mL)。与养殖合作社或养殖小区模式相比，散养和规模化模式生产的原料水牛奶样HT-2含量均显著低于养殖合作社或养殖小区模式(P<0.05)。与散养模式相比，规模化模式生产的原料水牛奶样T-2含量显著降低(P<0.05)。各饲养模式生产的原料水牛奶中α-ZEL、ZEN、DON和OTA含量均无显著差异(P>0.05)。

表4 不同养殖模式生产的原料水牛奶中其他霉菌毒素含量

2.2 广西地区不同饲养模式下不同季节水牛奶中霉菌毒素的污染状况

2.2.1 水牛奶中AFM1的污染状况 由表5可知，春季和秋季各饲养模式生产的原料水牛奶中AFM1含量均低于中国限量标准0.5 μg/kg，但秋季散养和规模化养殖各有1个奶样AFM1含量超过欧盟限量标准(0.05 μg/kg)，且秋季AFM1平均含量高于春季。春季样品中AFM1的检出率高于秋季，春季和秋季样品中AFM1的检出率分别为37.50%和29.17%。在3种饲养模式中，春秋两季散养样品中AFM1检出率均最低，春季样品中养殖合作社或养殖小区检出率最高为62.50%，秋季样品中规模化养殖场检出率最高为37.50%。

表5 原料水牛奶中AFM1含量

2.2.2 水牛奶中OTA的污染状况 由表6可知，春季和秋季各饲养模式生产的原料水牛奶中OTA的含量均低于欧盟限量标准2 ng/mL，OTA的成人PTWI均低于JECFA设定值100 ng/kg BW。秋季各饲养模式生产的原料水牛奶中OTA的平均含量均高于春季。

表6 原料水牛奶中OTA含量

2.2.3 水牛奶中HT-2和T-2的污染状况 由表7和8可知，春季和秋季各模式生产的原料水牛奶中HT-2和T-2的成人PMTDI均远远低于JECFA设定值60 ng/kg BW。春季和秋季养殖合作社或养殖小区生产的原料水牛奶中HT-2含量均显著高于散养和规模化饲养模式(P<0.05)。

表7 原料水牛奶中HT-2含量

表8 原料水牛奶中T-2毒素含量

2.2.4 水牛奶中ZEN和α-ZEL的污染状况 由表9和10可知，春季和秋季各饲养模式生产的原料水牛奶中ZEN和α-ZEL秋季的成人PMTDI均远远低于JECFA设定值500 ng/kg BW。春季和秋季散养模式生产的水牛奶中ZEN和α-ZEL含量均最低。春季和秋季养殖合作社或养殖小区生产的水牛奶中α-ZEL含量均最高。

表9 原料水牛奶中ZEN含量

表10 原料水牛奶中α-ZEL含量

2.2.5 水牛奶中DON的污染状况 由表11可知，春季和秋季各饲养模式生产的原料水牛奶中DON的成人PMTDI均远远低于JECFA设定值1 000 ng/kg BW。秋季各养殖模式生产的原料水牛奶中DON的平均含量均高于春季。

表11 原料水牛奶中DON含量

3.1 不同饲养模式下水牛奶中霉菌毒素的污染状况分析

黄曲霉毒素(aflatoxins，AFs)由寄生曲霉、黄曲霉和少量特异曲霉等真菌经聚酮而产生的次级代谢产物[23]。目前，已发现有20多种AFs及相关衍生物[24]，其中，黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)毒性最强，在饲料收割或储存不当时易产生AFB1从而污染饲料，当奶牛摄入被AFB1污染的饲料后分泌的牛奶中会出现AFB1的羟基化代谢产物AFM1[25-26]。牛奶经巴氏杀菌后，AFM1几乎不被破坏，且AFM1具有强致癌性，严重影响人类健康，因此，许多国家和组织都调查了牛奶中AFM1的污染水平，且对乳及乳制品中AFM1设定了较为严格的限量标准[17-18,27-28]。谢文沛[29]在甘肃省7个市的奶牛规模化和散养共采集252个原料水牛奶样品，126个(50%)检测出AFM1，所有检出样品AFM1含量均低于中国的国家限量标准，其中3个(1.19%)样品超过欧盟标准，规模场生产的牛奶中AFM1的平均含量和检出率均低于散户。本试验结果表明，规模化和养殖合作社或养殖小区养殖生产的水牛奶中AFM1的平均含量低于散养，但水牛奶中AFM1的检出率却高于散养，可能由于散养饲喂的精料以品牌精料为主，饲料原料的霉菌毒素污染率低，且散养精粗饲料配比不固定，为降低饲养成本，会更多选择新鲜粗饲料。另外，规模化和养殖合作社或养殖小区养殖饲喂青贮饲料较散养多，而青贮饲料是最容易受真菌感染的饲料品种之一[30]。国内对原料水牛奶中AFM1的污染水平研究较少，Guo等[31]2016―2017年从广西、贵州、云南和广东省的奶水牛养殖场采集136个原料水牛奶样品，其中85个(62.5%)原料水牛奶样品中检测到AFM1，含量在4～243 ng/kg之间，均未超过中国限量标准，但8个(5.9%)样品超过欧盟标准，其中，广西样45个样品AFM1检出率为66.7%，超欧盟标准的有4个(8.89%)。本试验结果显示，全部水牛奶样品的AFM1含量均低于中国限量标准0.5 μg/kg，但样品AFM1检出率(33.33%)和超欧盟限量标准率(4.17%)均低于Guo等[31]的研究结果，可能由于近几年广西奶水牛养殖管理技术不断提升，更注意饲料霉菌毒素污染控制。国外许多国家开展了水牛奶中AFM1污染水平研究，意大利南部、埃及伊斯梅利亚、土耳其、伊朗阿瓦兹和印度的水牛奶中AFM1的检出率分别为7.2%[30]、52.0%[32]、27.0%[11]、38.7%[33]和50.0%[34]。Hussain等[35]采集了巴基斯坦旁遮普省55个水牛奶样品，其中19个(34.5%)样品检出AFM1，15.8%样品中AFM1含量高于欧盟标准。本研究的原料水牛奶AFM1检出率高于意大利及土耳其，与Hussain等[35]研究结果相似。

目前，牛奶中霉菌毒素的研究主要集中在AFM1，然而，牛奶中还存在HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON、OTA等霉菌毒素，它们对动物及人类健康也会产生不同程度的影响。Huang等[36]开展牛奶中霉菌毒素检测研究，发现牛奶中存在AFM1、OTA、ZEA和α-ZEL，其中，含2、3和4种霉菌毒素所占的比例分别为15.0%、45.0%和22.0%。Frey等[37]采集巴西68份液态奶样本检测其中黄曲霉毒素，结果表明AFM1、OTA、伏马毒素B1(FB1)、FB2、α-ZEL和β-ZEL的检出率分别为8.8%、25.0%、14.7%、4.4%、57.4%和41.2%，21个(30.9%)样本中含有2～4种霉菌毒素，AFM1未超过巴西的限量标准(500 ng/L)，其他霉菌毒素的每日摄入量(PDI)均未高于推荐值。本试验研究结果也表明，各饲养模式生产的原料水牛奶中HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN和DON的成人PMTDI远远低于JECFA设定值。因此，广西地区水牛奶是安全的，不会对消费者健康产生显著影响。水牛奶中多种霉菌毒素共存现象可能与本研究采用的检测方法的检出限较低有关，还与中国饲料中存在多种霉菌毒素共污染严重有关[38]。

3.2 不同季节水牛奶中霉菌毒素的污染状况分析

不同季节奶牛饲喂的饲料种类及饲粮配制不同均容易引起牛奶中霉菌毒素的含量出现显著季节动态变化[39]。Roma等[30]开展意大利南部水牛奶和牛奶中AFM1污染水平及季节变化调查结果表明，水牛奶及牛奶中AFM1污染的发生率在秋季明显高于温暖季节(主要是春季)。Miocino-vic等[40]对塞尔维亚牛奶进行了为期3年(2013-2015年)的检测结果表明，秋季奶样中AFM1含量平均值在四季中最高。Marnissi等[41]采集摩洛哥4个行政管理区域传统奶牛场的四季牛奶样品48个，13个(27.08%)样品检出AFM1，其中有4个样品(3个为秋季样品)AFM1含量超过欧盟标准，秋季奶样AFM1平均含量和检出率均高于其他季节。谢文沛[29]研究表明，甘肃地区牛奶中AFM1的发生率和含量均在秋季呈现最大值，而夏季呈现最小值，且春季散户牛奶中AFM1的检出率高于规模场。本试验结果也表明，秋季AFM1平均含量高于春季，且AFM1含量超过欧盟标准的2个样品均来自秋季，但春季AFM1的检出率高于秋季，可能由于广西春季回南天空气湿度大饲料普遍易受霉菌毒素的污染，而秋季AFM1平均含量高于春季，也可能是由于春季饲喂青绿饲料较秋季多，秋季大部分奶水牛养殖场饲喂青贮饲料偏多。研究表明青贮饲料较其他种类饲料AFB1污染程度较高[29]。本试验结果散养春秋两季样品中AFM1检出率均最低，可能是由于奶水牛散养饲喂品牌精料霉菌毒素污染少，且较规模化养殖饲喂青绿饲料较多，青贮饲料较少。Frey等[37]研究表明，巴西牛奶样品中秋季OTA、FB1、FB2、α-ZEL和β-ZEL的PDI低于春季。本试验结果显示，秋季各饲养模式生产的原料水牛奶中OTA和DON的平均含量均高于春季，该试验结果与Frey等[37]结果基本一致。综上，广西地区的原料水牛奶霉菌毒素污染程度秋季高于春季，但春季原料水牛奶中AFM1的检出率高于秋季。

广西地区各饲养模式生产的原料水牛奶中AFM1含量均低于中国限量标准，HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN和DON的成人PMTDI和OTA的成人PTWI均低于JECFA设定值。原料水牛奶霉菌毒素污染程度秋季高于春季，但春季原料水牛奶中AFM1的检出率高于秋季，散养春秋两季样品中AFM1检出率均最低。因此，就霉菌毒素而言，当前广西地区原料水牛奶是安全的。