不同益生菌配比发酵对苹果汁主要香气成分的影响

陈月星,谭思远,李倩钰

(1.商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西 商洛 726000;2.陕西省秦岭特色生物资源产业技术研究院,陕西 商洛 726000)

益生菌生长于人体肠道及生殖系统内,有助于维持人体健康以及改善人体微生态平衡,是对人体有益的一类微生物,如动物双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等[1-2]。据报道,益生菌可以改善和促进人体肠道健康,增强人体的免疫力,缓解乳糖不耐受患者的症状,降低人体内的胆固醇,帮助人体产生所需的维生素,从而增强人体对营养的吸收和利用。有研究表明,在食品中加入益生菌对人体健康十分有益,能够提高免疫力,维持肠道微生态平衡和降低患癌风险[3-6]。

近年来,随着果蔬深加工技术的发展,益生菌在果蔬汁发酵中的研究报道屡见不鲜,益生菌发酵不仅可以改善果蔬制品的风味,增加果蔬制品的医疗保健作用,而且大大丰富了果蔬制品的种类。张桂芝等[7]利用乳酸菌发酵研制出新型火龙果复合发酵果蔬汁饮料;黄杰等[8]应用植物乳杆菌和发酵乳杆菌对香蕉胡萝卜复合果蔬汁进行发酵,并确定其最佳发酵工艺条件;陈树俊等[9]采用不同益生菌发酵复合果蔬汁,并对发酵前后抗氧化活性和工程成分进行对比分析,结果表明,与未发酵样品相比,发酵果蔬汁多酚、黄酮质量浓度显著升高(P＜0.05),各样品对DPPH 自由基、·OH、ABTS阳离子自由基清除能力较消化前增强,且在模拟胃消化阶段升高更明显。然而,目前益生菌发酵果蔬汁的研究主要集中在理化指标的分析以及工艺条件优化上,如董曼等[10]采用SPME-GC-MS研究了自然发酵和接种发酵树莓酒中的香气物质,发现发酵后产生了具有醇香味的酯类物质。马晓伟等[11]以紫心火龙果作为发酵原料,添加由产乳酸芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌组成的复配发酵剂0.1 g/100 m L,发酵后火龙果饮料色泽自然透亮且具有清雅和谐的果香。刘佳奇等[12]对乳酸菌发酵茶饮料配方进行了优化研究,确定植物乳酸菌发酵剂接种量质量浓度为1%,发酵温度37 ℃,发酵时间36 h。孙达锋等[13]对益生菌发酵银杏汁进行优化,发现发酵后果汁香味浓郁,质地细腻,酸味适中。目前,在发酵果蔬汁中添加的益生菌菌种选择比较单一[14-17],且多为单菌发酵和双菌发酵,此外对于不同益生菌配比发酵果汁对于果汁本身香气成分影响方面的研究较少,基于此,本试验选用苹果作为原料,研究动物双歧杆菌、嗜热链球菌及嗜酸乳杆菌的单一菌种和复合菌种分别发酵苹果汁对苹果汁特征香气成分的影响。采用紫外-可见分光光度计测定发酵过程中苹果汁光密度的变化,顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术检测发酵苹果汁的香气成分,分析不同果汁样品中的特征香气成分的含量差异,以期为益生菌发酵果蔬汁的研究与应用提供一定的理论依据。

1.1 材料与试剂

红富士(Malus pumilaMill.)苹果,购于陕西商洛市华润万家超市,大小均一,无机械损伤,无病害或腐烂。

益生菌菌种有动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),购于上海保藏生物技术中心。

MRS肉汤培养基,3-辛醇(标准品,纯度＞98%),氯化钠(分析纯)。

1.2 仪器与设备

2000JP-1型榨汁机;YXQ-LS-70A 型立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司),Allega X-30R 型高速冷冻离心机(贝克曼库尔特商贸＜中国＞有限公司),SW-CJ-1F 型超净工作台(苏州净化设备有限公司),HWS-80型智能恒温恒湿箱(上海索谱仪器有限公司),GCMS-TQ8040气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司),UV-1700紫外-可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司),50/30 μm 聚 二 甲 基 硅 氧 烷/二 乙 基 苯(PDMS/DVB)萃取头。

1.3 试验方法

1.3.1 苹果汁的制备与发酵 挑选大小均一无

机械损伤,无病害或腐烂的苹果,经清洗后去核切分放入榨汁机中处理,加入抗坏血酸、果胶酶充分进行护色、酶解,最后抽滤并调节p H 冷冻,待用。将保存于甘油管的3 株益生菌分别置于MRS液体培养基中,37 ℃静置培养24 h,使菌种活化。向活化后的菌液中分别接种100 m L 苹果汁,37 ℃条件下静置培养18 h,当活菌数约达1×107CFU/m L后,将3种菌株分别按照单一菌种和多菌组合的方式(如表1所示),以体积分数2%接种量接种于500 m L 苹果汁中,37 ℃发酵24 h,每隔2 h取样测定OD 值,发酵结束后置于-20 ℃条件下保存,待用[18]。试验处理及编号如表1所示。

表1 试验处理Table 1 Treatment of experiment

1.3.2 苹果汁OD 值测定 研究表明,发酵果蔬汁的光密度值与菌体数具有一定的相关关系[19],因此可在600 nm 的波长下测定出OD 值从而计算出发酵液中的活菌数。每个样品重复5 次,取平均值。

1.3.3 香气成分的提取 主要采用顶空式取样,吸附法提取香气成分,准确移取5 m L 样品放入20 m L的进样瓶中,再加入2 g氯化钠与0.4 g/L 3-辛醇作为内标物。在45 ℃的环境中平衡进样瓶30 min,之后将经过老化处理过的50/30μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯萃取头插入其中,顶空吸附35 min后解吸[20-21]。

1.3.4 色谱条件与质谱条件 色谱条件[22-23]:30 m×0.25 mm,0.25μm DB-17MS毛细管色谱柱;进样口温度240 ℃;起始温度为40 ℃,保持5 min后以4 ℃/min的速度升温至120 ℃,再以6 ℃/min的速率升温至230 ℃,保持10 min。

质谱条件[24]:电离方式为轰击电离;电子能量70 e V;扫描质量范围为35～500 amu;离子源温度230 ℃。载气为He;流速为1.92 m L/min;以不分流方式进样。

1.3.5 数据统计分析 定性分析:将样品检测结果与质谱数据库、保留时间和匹配度进行对比,有效的香气成分为匹配度＞85的物质。

定量分析:检测样品时加入相同质量浓度的3-辛醇作为内标物,重复测定3次,并根据下式进行计算:

香气物质含量=(各物质的峰面积/内标物的峰面积)×内标物质浓度

香气值=(香气物质含量/香气阈值)×1 000

上面两式中,香气物质含量单位为mg/L,内标物质浓度单位为mg/L,香气阈值单位为μg/L。

计算出各组发酵苹果汁的香气物质含量与香气值后,应用SPSS16.0软件采用t检验法分析各组结果之间差异的显著性。

2.1 苹果汁发酵过程中OD值的变化

苹果汁发酵过程OD 值的变化如图1所示,随着发酵时间的延长,各组样品OD 值呈对数趋势上升,这与李维妮等[22]所研究的多种乳酸菌发酵苹果汁时的微生物生长曲线相符合。在样品发酵的过程中,前10 h各组样品的光密度值并未发生明显变化,总体趋于平稳;在样品发酵12 h之后,各组样品的光密度值开始快速增长,在发酵进行到18 h时,样品光密度的增长开始变得缓慢。之所以出现上述变化趋势是因为,根据微生物的生长规律,刚接种到样品中的菌种,为适应新的环境调节自身代谢系统,细胞体积增大但数目不会增加;经过一定适应期之后,菌种适应了样品中的环境开始以几何级数增长,样品光密度值快速增长;当样品中菌体数目增长到一定程度后,营养物消耗以及菌种代谢所产生的酸、醇等物质积累,限制了菌体的继续繁殖,使样品光密度值变化趋于平稳。如图1所示,在发酵终点时,单菌发酵组的光密度值普遍低于多菌发酵组的光密度值,第4组样品的光密度值最高,其次是第9组、第8组和第6组依次递减,第1组样品的光密度值最低,表明多菌种配比发酵可在一定程度上使苹果汁中活菌数增加。

图1 不同苹果汁发酵组OD值的变化Fig.1 Change of OD value during fermentation

2.2 苹果汁的香气物质含量分析

共检测出香气成分31 种,其中醇类物质9种,酯类物质16种,其他香气成分6种。加入不同益生菌配比的苹果汁发酵2 d后,经过检测发现样品中都含有醇类香气物质,但是种类和含量存在显著差异。10组样品中共检测出9种醇类香气成分,占总香气成分的46.3%～37.7%,分别是乙醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、正戊醇、正己醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、正辛醇、芳樟醇和香茅醇。其中,正己醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、正辛醇、芳樟醇和香茅醇均属于高级醇,可以使果汁产生清新淡雅的香气,同时也作为其他香气物质的良好溶剂以保持苹果汁香气的整体性。

如表2所示,在所测的10组样品中6-甲基-5-庚烯-2-醇的含量最高,约为1.463～1.325 mg/L;其次是2-甲基-1-丁醇,含量为1.087～0.989 mg/L;乙醇含量为0.972～0.873 mg/L;正丁醇含量为0.437～0.389 mg/L;正己醇含量为0.272～0.216 mg/L。总体而言,除第8组样品外,单一菌种发酵的样品中醇类香气物质的含量普遍低于多菌种混合发酵的样品,说明多菌种混合发酵在一定程度上有助于醇类香气物质的生成。该结论与林晓姿等[3]所研究的乳酸发酵葡萄全汁中植物乳杆菌、副干酪乳杆菌副干酪亚种的单菌株及其复配菌样品风味分析的结果一致。

表2 不同苹果汁发酵组的香气物质含量Table 2 Contents of aroma substances in fermentation group of apple juice

酯类香气物质是苹果汁所有香气物质中含量最多且种类最为丰富的香气成分。有研究表明,富士苹果中的酯类香气物质多达50余种,且含量最高,对整体香气的表达起至关重要的作用[25]。本次试验共检测出16种酯类香气物质,占总香气物质的61.3%～58.5%。由表4可知,含量较高的前3 个成分分别是2-甲基丁酸乙酯,含量为1.708～1.539 mg/L;丁酸乙酯,含量为1.716～1.524 mg/L;2-甲基丁基乙酸酯,含量为1.403～1.233 mg/L;含量最低的是丙酸丁酯,平均含量仅有0.012 mg/L左右。由单一菌种发酵的样品中酯类香气物质的平均含量普遍低于多菌种发酵的样品。

在所有样品中除检测出大量的醇类、酯类香气物质外,还检测出一些其他类型的具有挥发性的香气成分,如酚类、醛类和酮类。这些物质虽然含量较低,但对发酵苹果汁的整体香气同样具有一定的贡献。本试验在10组样品中共检测出6种其他类型的香气物质,分别是乙醛、反-2-己烯醛、甲基庚烯酮、香叶基丙酮、乙偶姻、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。这些物质的含量基本为0.254～0.377 mg/L,占总香气含量的2%～3.3%,且单菌种发酵的样品含量均低于多菌混合发酵的样品。

2.3 苹果汁香气物质的香气值分析

根据现有资料查询上述香气成分的香气阈值,并通过样品中香气物质的含量与该物质香气阈值之比,确定该成分的香气值。香气值越大对香气的贡献越大,香气值大于1被认为是在苹果汁香气中起主要作用的成分,即苹果汁的特征香气成分。在检测出的31种香气成分中,可作为发酵苹果汁特征香气的共有17种,其中醇类香气物质3种、酯类香气物质11种、其他香气成分3种。

2.3.1 苹果汁中醇类香气物质的香气值分析虽然醇类香气物质在总香气物质中所占的比重较大,但9种醇类香气物质的香气值均不高,因此能够作为典型香气的成分并不多。在第1组、第2组、第3组、第8组、第9组和第10组的样品中仅有2-甲基-1-丁醇和芳樟醇两种物质的香气值大于1,可以作为特征香气;第4组、第5组、第6组和第7组的样品中则有2-甲基-1-丁醇、芳樟醇和香茅醇3种物质可作为特征香气。上述香气物质的香气阈值很高,且其香气值较低因此对样品香气的整体贡献并不大。

各组样品2-甲基-1-丁醇香气值分析如图2所示,2-甲基-1-丁醇香气阈值为500μg/L,在各组样品醇类香气物质中的含量为1.087～0.989 mg/L,能够赋予苹果汁清香,是苹果汁的常见特征香气之一。由图2可知,各组样品中2-甲基-1-丁醇香气值约为2.174～1.978,其中第4组香气值最高,其次为第5组,二者与其他组之间差异显著(P＜0.05),第1组香气值最低。

图2 2-甲基-1-丁醇的香气值分析Fig.2 Aroma value analysis of 2-methyl-1-butanol

各组样品芳樟醇香气值分析如图3所示,芳樟醇又名沉香醇,属于链状萜烯醇类,具有铃兰香气,在许多植物中均存在此类物质,香气阈值为6 μg/L,香气值为6.333～5.167,是对整体香气贡献最大的醇类物质。由图3可见,在10组样品中芳樟醇香气值以第5组最高,且与其他组差异显著(P＜0.05),其次为第6组和第2组。

图3 芳樟醇的香气值分析Fig.3 Aroma value analysis of linalool

各组样品香茅醇香气值分析如图4所示,香茅醇为一种萜类物质,具有类似新鲜玫瑰的特殊香气。10 组样品中含量约为0.054～0.032 mg/L,香气阈值为40μg/L。由图4 可见,第4组、第5组、第6组和第7组的香气值大于1,因此可作为上述4组样品的特征香气,其中第6组的香气值显著高于其他组(P＜0.05)。

图4 香茅醇的香气值分析Fig.4 Aroma value analysis of geraniol

2.3.2 苹果汁中酯类香气物质的香气值分析10组样品中检测到的16种酯类香气物质中有11种物质的香气阈值大于1μg/L,分别是丙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、丁酸丙酯、戊酸乙酯、乙酸己酯和2-甲基丁酸丁酯。其中,丙酸乙酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯以及2-甲基丁酸乙酯虽然含量极低但香气值较为理想,所以对整体香气具有一定的贡献。在所有酯类特征香气中丁酸乙酯、乙酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯和乙酸己酯的香气值非常高,对整体香气贡献很大,赋予了苹果汁强烈的果香。

各组样品2-甲基丁酸乙酯香气值分析如图5所示,2-甲基丁酸乙酯香气阈值为0.2μg/L,广泛存在于苹果、草莓等水果中,具有香甜青苹果味。在所测定的10组样品中平均含量为1.596 mg/L,香气值普遍较高,是对整体香气贡献最为突出的物质。由图5可知,在10组样品中第4组与第6组的香气值最高,且与其他组之间差异达到显著水平(P＜0.05),以第7组香气值最低。

图5 2-甲基丁酸乙酯的香气值分析Fig.5 Aroma value analysis of ethyl 2-methyl butyrate

各组样品丁酸乙酯香气值分析如图6所示,丁酸乙酯香气阈值为1μg/L,存在于香蕉、菠萝等水果中,具有苹果氧化味、甜香味。在所测10组样品中,第4组和第6组样品的香气值最高,且与其他组之间差异达到显著水平(P＜0.05),以第8组香气值最低。

图6 丁酸乙酯的香气值分析Fig.6 Aroma value analysis of ethyl butyrate

各组样品乙酸乙酯香气值分析如图7所示,乙酸乙酯在苹果、香蕉、芒果、红茶、白酒、红酒中有发现,香气阈值为2μg/L,具有果味、溶剂味。在所测10组样品中,第6组样品的香气值最高,其次为第5 组、第4 组,三者均显著高于其他组(P＜0.05),以第9组样品香气值最低。

图7 乙酸乙酯的香气值分析Fig.7 Aroma value analysis of ethyl acetate

各组样品2-甲基丁基乙酸酯香气值分析如图8 所示,2-甲基丁基乙酸酯香气阈值为11 μg/L。在所测10组样品中,第4组和第6 组样品中的香气值最高,其次为第5组和第7组,显著高于剩余组样品香气值(P＜0.05),第1组的香气值最低。

图8 2-甲基丁基乙酸酯的香气值分析Fig.8 Aroma value analysis of 2-methyl-butyl acetatee

各组样品乙酸丁酯香气值分析如图9所示,品乙酸丁酯香气阈值为66,具有令人愉悦的果香。在所测10组样品中,第5组样品的香气值最高,显著高于其他组(P＜0.05),其余各组之间差异不显著,其中第1组香气值最低。

图9 乙酸丁酯的香气值分析Fig.9 Aroma value analysis of butyl acetate

除这些香气物质以外,还有2-甲基丁酸丁酯、丁酸丙酯、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丙酸乙酯、丙酸乙酯、戊酸乙酯也属于苹果汁的特殊香气物质。其中,2-甲基丁酸丁酯具有青苹果味,丁酸丙酯具有类似菠萝、香蕉的香韵,两者单菌发酵的香气值均低于混菌发酵。丙酸乙酯具有类似菠萝的香气,戊酸乙酯具有鲜苹果的香气,单菌发酵组的香气值普遍较低。此外,有研究表明若样品中乙酸乙酯的含量过高,会使样品产生不愉快的溶剂气味[26]。

2.3.3 苹果汁其他类香气物质的香气值分析在所检测的6种其他香气成分中,香气值大于1的共有3种,分别是乙醛、反-2-己烯醛、甲基庚烯酮。其中乙醛和反-2-己烯醛在所有样品中的香气值均大于1,因此可以作为发酵苹果汁的特征香气成分。

各组样品乙醛香气值分析如图10所示,乙醛香气阈值为20,由于样品中的菌种进行糖代谢而产生的中间产物,在各组样品中的含量均不高,但香气值较为理想,是苹果汁的特征香气成分,其中第9组、第4组、第2组的香气值尤为突出,显著高于其他组(P＜0.05),以第8组香气值最低。

图10 乙醛的香气值分析Fig.10 Aroma value analysis of acetaldehyde

各组样品反-2-己烯醛香气值分析如图11所示,反-2-己烯醛香气阈值为17μg/L,具有令人愉悦的果香及绿叶香气。在第3组样品中并未检测出此类物质的存在,但在除第3组以外的样品中均有检出且香气值大于1。第4组与第9组样品的香气值含量尤为突出,与其他组之间差异显著(P＜0.05)。

图11 反-2-己烯醛的香气值分析Fig.11 Aroma value analysis of trans-2-hexenal

各组样品甲基庚烯酮香气值分析如图12所示,甲基庚烯酮香气阈值为50μg/L,具有类似柑橘的香气,是合成芳樟醇的中间体。在所测的10组样品中第1组与第5组样品的香气值最高,但第4组与第7组的香气值则不理想。

图12 甲基庚烯酮的香气值分析Fig.12 Aroma value analysis of methyl heptenone

除上述3种特征香气外,还在第3组样品中检测出了少量香叶基丙酮,该物质香气阈值为60,具有甜味和青草味;在第3组、第4组、第8组和第9组样品中检测出了乙偶姻,该物质是由于样品内菌种发酵苹果酸过程中柠檬酸分解为丙酮酸时产生的中间代谢产物,具有奶香味,在样品中含量极少,对整体香气贡献小。

2.4 香气成分含量及香气值t检验分析

将所有样品中香气物质的含量及其香气值分为单一菌种和混合菌种两组进行t检验,结果表明,单一菌种发酵的样品与混合菌种发酵的样品的香气物质含量(P=0.031)及其香气值(P=0.048)的差异均达到显著水平,说明混合菌种发酵的样品中香气成分的含量明显高于单一菌种发酵的样品,可赋予苹果汁更加浓郁的香气。

苹果汁因其口感优良且富含糖类、有机酸、多酚、维生素等多种营养成分,而广受人们喜爱,其香气成分是影响其独特风味与品质的重要因素[25]。经过益生菌发酵后的果汁既不失水果的自然风味,又具有发酵的独特风味[27-29]。苹果汁中的香气成分复杂,且多数含量较低,目前采用的富集和分析方法主要是顶空固相微萃取法与气相色谱-质谱等设备联用,检测挥发性香气成分具有快捷、经济、安全、选择性好且灵敏度高等优点[22]。

本研究共检测出31种香气成分,可作为发酵苹果汁的特征香气的共有17种,其中,反-2-己烯醛和香茅醇由于个别样品的香气值小于1只能作为个别样品的特征香气。在所有香气成分中,醇类香气物质在总香气物质中所占的比重相对较大,占总香气成分的46.3%～37.7%,但9种醇类香气物质的香气值均不高,因此能够作为典型香气的成分并不多。酯类香气占总香气物质的61.3%～58.5%,对整体香气的贡献最为明显,特别是2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丙酸乙酯和2-甲基丁基乙酸酯无论含量或香气值方面都对整体香气贡献尤为突出。在所有样品中除检测出大量的醇类、酯类香气物质外,还检测出一些其他类型的具有挥发性的香气成分,占总香气含量的2%～3.3%,如酚类、醛类和酮类。这些物质虽然含量较低,但对发酵苹果汁的整体香气同样具有一定的贡献。

香气成分是影响果品鲜食、加工质量及典型性的重要因素,因此分析和研究苹果汁的香气成分,对改善果汁的口感、品质具有重要意义。总体来看,在所测定的10组样品中,第4组样品在特征香气香气值以及香气种类、含量等方面优于其他各组样品。由单一菌种发酵所得样品在特征香气的种类、含量和香气值等方面均没有混合菌种发酵的样品优秀,且两者的差异显著性小于0.05。这进一步说明了混合菌种发酵在一定程度上赋予样品更浓郁的香气。这对今后发酵果蔬汁香气成分的研究提供一定的助力。