大血藤总酚酸调控微小RNA-155对缺氧复氧心肌细胞的细胞活性凋亡及氧化应激的影响

于梦，宋欣丽，孙丽，梁芳，鲁卫星

研究发现中药复方及中药有效提取物，能有效地抑制氧自由基的形成，控制炎症反应，从而达到保护损伤心肌的目的，在治疗心肌缺血再灌注损伤中具有广阔的应用前景。大血藤是我国特有植物，又名红藤、血藤，主要化学成分有酚酸类；
药理作用有镇痛，消炎，抗肿瘤、抗氧化等。研究表明大血藤总酚酸可通过保护脑组织免受炎症因子损伤，减少神经细胞凋亡等减少脑缺血再灌注损伤，起到对脑组织的保护作用。大血藤总酚酸还通过抗氧化与改善脑组织能量代谢保护大鼠脑缺血再灌注损伤。且有研究发现大血藤多米糖具有抗心肌缺血的作用。然而大血藤总酚酸是否对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用及其机制尚不清楚。研究报道病毒性心肌炎患儿外周血中高表达的miR-155 能够抑制Treg 免疫并加重心肌损伤。缺氧/复氧大鼠H9C2 心肌细胞中miR-155 高表达，下调miR-155 可促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，减轻心肌缺氧/复氧损伤。抑制miR-155 可通过有针对性地调节大鼠HIF-1α 来预防心肌缺血/再灌注损伤。表明抑制miR-155 具有保护心肌缺血/再灌注损伤的作用，因此，本实验旨在研究大血藤总酚酸是否对心肌缺血再灌注损伤的影响及其机制是否与miR-155有关，研究起止时间为2019年12月至2020年8月。

1.1 材料

心肌细胞H9C2（货号6200，上海中乔新舟生物科技有限公司）；
DMEM 培养基（货号A19008，上海传秋生物科技有限公司）；
实时荧光定量PCR 试剂盒（货号Qiagen204143，北京杰辉博高生物技术有限公司）；
噻唑蓝（MTT）试剂盒（货号8028，上海美轩生物科技有限公司）；
膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）试剂盒（货号K201-25，上海齐一生物科技有限公司）；
RIPA 蛋白裂解液（货号N653，上海恒渡生物科技有限公司）；
肌酸激酶试剂盒（货号1534651026）、LDH试剂盒（货号1531916014）、丙二醛试剂盒（货号1534619774）（上海江莱生物科技有限公司）。大血藤总酚酸由河南中医学院化学室提供。

1.2 缺氧复氧模型的建立

取对数生长期心肌细胞H9C2 接种于24 孔培养板中，将培养板置于含95% 氮气和5% 二氧化碳混合气体的培养箱中培养4 h，然后换成正常培养基在含95% 氮气和5% 二氧化碳的培养箱中培养12 h。

1.3 实验分组

将心肌细胞H9C2使用随机数字表法随机分为以下几组：对照组：用含10% 胎牛血清的DMEM 培养基正常培养；
缺氧/复氧组：缺氧4 h，复氧12 h，具体方法参考“1.2”；
大血藤总酚酸低、中、高浓度组：造模前分别用12.5、25.0、50.0 mg/L 大血藤总酚酸培养2 h，然后进行缺氧复氧处理；
大血藤总酚酸-H+NC 组：将miR-155 模拟物阴性对照转染至H9C2 中再用50.0 mg/L 大血藤总酚酸培养，最后进行缺氧复氧处理；
大血藤总酚酸-H+miR-155 mimic 组：将miR-155 模拟物转染至H9C2中再用50.0 mg/L 大血藤总酚酸培养，最后进行缺氧复氧处理。

1.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-155表达水平

提取细胞总RNA，逆转录成互补DNA（cDNA），按试剂盒说明进行PCR，相对表达量采用2法计算。miR-155 正向引物序列：5"-CTCTAATGGTGGCACAAA-3"，反向引物序列：5"-TGATAAAAACAAACATGGGCTTGAC-3"；
U6 正向引物序列：5"-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3"，反向引物序列：5"-AAAATATGGAACGCTTCACGA-3"。

1.5 MTT 法检测细胞增殖

各组细胞培养48 h 后每孔加20 μL 的MTT 溶液，培养4 h 后弃去培养液，加150 μL二甲基亚砜（DMSO），充分振荡反应，用酶标仪检测490 nm处吸光度。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

各组细胞培养48 h 后用胰酶消化细胞，制成细胞悬液，洗涤细胞后分别加Annexin V-FITC 和PI各5 μL 混匀，常温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。

1.7 蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达

提取细胞总蛋白，定量后取适量蛋白样品进行十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、转膜、封闭，加入稀释好的一抗，4 ℃孵育过夜，加入稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温摇床孵育2 h，化学发光试剂ECL 显色，暗室下显影、定影。Quantity-One分析蛋白条带灰度值。蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。

1.8 试剂盒检测细胞培养液中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量

各组细胞培养48 h 后，取心肌细胞培养上清液，按试剂盒方法操作，用分光光度法检测。

2.1 大血藤总酚酸对缺氧复氧心肌细胞的细胞活性及miR-155 表达的影响

与对照组相比，缺氧/复氧组心肌细胞中miR-155 表达水平升高，细胞吸光度降低（

P

＜0.05）；
与缺氧/复氧组相比，大血藤总酚酸中、高浓度组miR-155表达水平降低，细胞吸光度升高，且呈浓度依赖性（

P

＜0.05），而大血藤总酚酸低浓度组miR-155 表达水平和细胞吸光度无明显变化。见表1。

表1 大血藤总酚酸对细胞活性和miR-155表达的影响/±s

2.2 大血藤总酚酸对缺氧复氧心肌细胞凋亡的影响

与对照组相比，缺氧/复氧组心肌细胞凋亡率升高，活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）表达水平升高，胱天蛋白酶-3 前体（pro-caspase-3）表达水平降低（

P

＜0.05）；
与缺氧/复氧组相比，大血藤总酚酸中、高浓度组心肌细胞凋亡率降低，cleaved-caspase-3 表达水平降低，pro-caspase-3 表达水平升高，且呈浓度依赖性（

P

＜0.05），而大血藤总酚酸低浓度组细胞凋亡率和相关蛋白表达水平无明显变化。见图1、表2。

图1 大血藤总酚酸对凋亡蛋白表达的影响

表2 大血藤总酚酸对凋亡率和凋亡蛋白表达的影响/±s

2.3 大血藤总酚酸对缺氧复氧心肌细胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量的影响

与对照组相比，缺氧/复氧组心肌细胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量升高（

P

＜0.05）；
与缺氧/复氧组相比，大血藤总酚酸中、高浓度组心肌细胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量降低，且呈浓度依赖性（

P

＜0.05），而大血藤总酚酸低浓度组肌酸激酶、LDH、丙二醛含量无明显变化。见表3。

表3 大血藤总酚酸对肌酸激酶、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛含量的影响/±s

2.4 过表达miR-155 对大血藤总酚酸处理的缺氧复氧心肌细胞的细胞活性及凋亡的影响

与大血藤总酚酸-H+NC 组相比，大血藤总酚酸-H+miR-155 mimic 组细胞吸光度降低，心肌细胞凋亡率升高，cleaved-caspase-3 表达水平升高，pro-caspase-3 表达水平降低（

P

＜0.05）。见图2、表4。

表4 过表达miR-155可逆转大血藤总酚酸对细胞活性和凋亡的影响/±s

图2 过表达miR-155可逆转大血藤总酚酸对凋亡蛋白表达的影响

2.5 过表达miR-155 对大血藤总酚酸处理的缺氧复氧心肌细胞肌酸激酶、LDH、丙二醛含量的影响

与大血藤总酚酸-H+NC组相比，大血藤总酚酸-H+miR-155 mimic 组肌酸激酶、LDH、丙二醛含量升高（

P

＜0.05）。见表5。

表5 过表达miR-155可逆转大血藤总酚酸对肌酸激酶、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛含量的影响/±s

心肌缺血再灌注损伤机制复杂，心肌细胞凋亡、氧化应激、炎症因子等均与其相关。因此，探索如何减少心肌缺血再灌注损伤具有重要的临床意义。心肌缺血再灌注损伤发生时细胞内自由基大量产生，发生过氧化反应；
丙二醛是细胞膜脂质过氧化的产物，大量丙二醛可破坏细胞膜完整性，使细胞内的乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶漏出细胞外；
因此检测肌酸激酶、LDH、丙二醛的含量可间接反应细胞膜损伤程度。

研究发现中医药预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用。研究报道大血藤不同极性部位对氧化应激损伤成骨细胞具有保护作用。且有研究报道鸡血藤提取物可通过影响心肌组织中LDH、肌酸激酶、超氧化物歧化酶（SOD）的活性从而对豚鼠离体心脏缺血再灌注损伤起保护作用。本实验用缺氧复氧处理心肌细胞模拟心肌缺血再灌注，不同浓度的大血藤总酚酸处理后，结果显示，中、高浓度处理组细胞吸光度升高，心肌细胞凋亡率降低，cleaved-caspase-3 表达水平降低，pro-caspase-3 表达水平升高，心肌细胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量降低；
表明中、高浓度的大血藤总酚酸可抑制心肌细胞凋亡和氧化应激反应，对缺氧复氧心肌细胞损伤有保护作用。

研究报道miR-155 可参与调控心肌细胞凋亡及氧化应激反应，如miR-155 的下调保护心肌细胞免于凋亡。

银耳银耳多糖可通过抑制miR-155 减轻巨噬细胞的氧化应激和炎症。本实验结果显示，大血藤总酚酸中、高浓度处理后缺氧复氧诱导的心肌细胞中miR-155 表达水平降低；
而过表达miR-155 可逆转大血藤总酚酸对缺氧复氧诱导的心肌细胞活性、凋亡和肌酸激酶、LDH、丙二醛含量的影响。提示，大血藤总酚酸可能通过调控miR-155影响缺氧复氧心肌细胞损伤。

综上所述，大血藤总酚酸可能通过下调miR-155抑制缺氧复氧心肌细胞的凋亡及氧化应激。

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