新生儿坏死性小肠结肠炎与肠道微生物群落关系的研究进展

王英豪，戴立英

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是NICU常见的消化道急症，死亡率高达30%。存活的NEC 病儿往往会出现后遗症，包括慢性喂养不耐受、短肠综合征和生长发育迟缓等，其病理特点是肠道黏膜损伤甚至全层坏死或穿孔，1978年，Martin等首次提出了NEC的3个阶段和分期标准，Ⅰ期为“可疑”期，X线片以胃潴留和轻度腹胀为特征。Ⅱ期为“肠梗阻”期，主要表现肠梗阻、水肿、肠壁积气征等。Ⅲ期为疾病的晚期，进展迅速恶化，易发生肠坏死，脓毒性休克，消化道出血，穿孔等严重并发症，此阶段常需要手术干预。近年来NEC 受到了广泛的关注，但其具体发病机制仍未完全明确。剖宫产婴儿、胎龄较小的婴儿、出生后使用抗生素和人工喂养的新生儿NEC 发生率较高。有研究发现NEC 前期肠道微生物群落已经出现异常，提示微生物学可能是防治NEC 的一个很有前途的治疗靶点。本研究就NEC 与肠道微生物群落关系的研究文献进行综述，为NEC 的预防及治疗提供参考依据。

近年来，随着高通量测序技术的发展，各种关于微生物组学的检测手段陆续出现大大扩展了我们对微生物群落的认识。肠道微生物群落拥有数千种细菌，它们在维持体内微生态平衡方面起着至关重要的作用。肠道菌群定植是一个程序化的过程，出生后婴儿的肠道最初被兼性厌氧菌定植，以杆菌为主，随着时间的推移出现专性厌氧菌，如拟杆菌、双歧杆菌和厚壁菌门。影响微生物早期定植的因素是多方面的，包括胎龄、分娩方式、喂养方式、环境因素、使用抗生素、抑酸药物等因素，潜在甚至可能是宫内传播。出生后新生儿肠道微生物定植经历两波发育，第一波菌群发育对于足月儿和早产儿来说没有区别，主要取决于分娩方式，阴道出生的婴儿最容易被母亲的阴道微生物感染，几项研究报道经阴道分娩的婴儿拟杆菌丰富度较高，以乳酸杆菌、普氏菌和双歧杆菌为主；
而剖宫产儿微生物群落差异较大，以葡萄球菌为主，而双歧杆菌和拟杆菌定植延迟，肠杆菌科定植率增加。第二波菌群发育因素在足月和早产儿之间有所不同，在足月儿中主要受喂养方式如母乳或配方奶喂养的影响，母乳喂养促进了更接近母亲的微生物群发展，其贡献来自母乳的含量和与乳晕皮肤的接触，母乳中含有人乳低聚糖（HMO），可刺激双歧杆菌和拟杆菌生长，帮助选择有益的微生物，为其提供生长的基质，降低机会性致病菌对新生儿肠道的侵袭，故母乳喂养婴儿的微生物群富含双歧杆菌和拟杆菌；
相比之下，配方奶喂养的婴儿仍然以链球菌、葡萄球菌和乳酸杆菌为主。而早产儿受喂养方式影响较小，微生物群主要以梭菌和肠杆菌为主要特征，双歧杆菌和拟杆菌数量较少。因此母乳喂养婴儿体内存在一种以双歧杆菌为主的微生物群落，而配方奶喂养的婴儿体内微生物虽多样化，但潜在有益菌水平较低。由于新生儿免疫系统不成熟，感染风险较大，临床医生经常会给予可疑或确诊感染的婴儿抗生素，抗生素的暴露对新生儿微生物群有很大的影响，延缓了有益细菌的定植，减少肠道微生物群的多样性，抗生素治疗可能导致新生儿（胎龄≤32 周和足月儿）第一个月肠道内细菌多样性降低，肠杆菌丰富度增加15% 左右，双歧杆菌数量明显减少。Patricio-S 等表明，在第一周接受5～7 d 经验性抗生素的婴儿，在出生后第2 周和第3 周，变形杆菌相对丰度增加至54% 左右（正常＜1%），细菌多样性降低。Zhou 等发现围产期抗生素暴露也可导致母亲阴道和新生儿肠道微生物菌群失调，且乳酸杆菌丰度显著下降40% 左右。抑酸疗法对早产微生物群也有明显的影响，通过抑制胃酸分泌加剧胃肠道殖民化，导致胃肠菌群失调。Gupta 等证明在早产儿中应用H2受体阻滞剂限制了粪便微生物群的多样性，以变形杆菌为主。这些因素综合起来，对新生儿肠道菌群的定植、微生物多样性的发展、菌群稳定性的增加、医院获得的潜在致病菌和双歧杆菌的定植等产生深远而有害的影响。

尽管对NEC 病理生理学研究进行了几十年研究，目前仍未发现单一的致病因素，与肠道微生物的研究发现侧重于肠道微生物失调，而不是一种特定的病原体。正常菌群在上皮细胞表面的生长繁殖形成了生物屏障，优先占领生存空间，妨碍或抑制外来致病菌的定植。当肠道菌群正常的定植过程遭到破坏或延迟，将导致肠道菌群结构发生改变，使正常菌群与宿主间的生态平衡失调，一些正常菌群成为机会致病菌，触发炎症反应，严重者甚至引起NEC。

对早产儿粪便微生物组进行测序的首批研究之一表明，微生物多样性降低，同时属于变形杆菌门的一个属的优势伴双歧杆菌丰富度减少是导致NEC 发病的关键。近年来，多项研究表明，早于NEC 发病前数天至数周，NEC 病儿已经发生肠道菌群失调且革兰阴性杆菌丰富度增多，即生态失调早于NEC 发病。几项对变形杆菌门的病例对照研究表明，在出生后3周以上出现NEC的早产儿，往往会在发病前数天至数周出现这种生态失调。Pammi等Meta分析指出变形杆菌的丰度的增加在胎龄＜27 周婴儿中最为明显，他们还发现这些NEC 病儿Alpha 多样性和Shannon 指数降低（Alpha 指一个特定区域或生态系统内的多样性，是反映丰富度和均匀度的综合指标；
Shannon 指数即种群之间物种多样性，其值越大表明菌群多样性越高），同时通过针对16S rRNA 细菌基因的高变区V3-V5的研究发现，与针对V1-V3 区域研究相比，变形杆菌的相对丰富度更高，厚壁菌门的丰富度更低。Ho 等对45 例出生体质量＜1500 g 早产儿的4 周内粪便进行连续分析发现，粪便γ-变形杆菌的总体比例随着出生年龄的增加而增加，且变形杆菌定植和NEC 发病率似乎在月经后同一时期[（31±3）周］达到高峰，在出生后≤2 周时变形杆菌相对丰度42.5% 左右，第三周变形杆菌相对丰度69.7%，第四周高达75.5%。为了进一步了解NEC 发生时的肠道菌群变化，Joann 等采用16s rRNA 基因测序及定量聚合酶链反应技术，分析了12例NEC 手术肠段和14例非NEC 手术肠段样本，发现NEC 组中变形杆菌门占主要地位，且葡萄球菌和梭状芽孢杆菌过表达。Warner 等对122例婴儿的2492个粪便样本研究发现，与健康婴儿相比，样本中28例NEC病儿γ-变形杆菌比例更高，1个月后最高峰可达80% 左右，梭状芽孢杆菌和Negativicutes 纲比例更低，仅为10% 左右。为排除外界环境和遗传因素影响，Suchitra 等对25周双胞胎（双胞胎A 无NEC，双胞胎B 最终发展为NEC）粪便样本进行16s rRNA 基因测序研究发现，在诊断为NEC 2 周前双胞胎的微生物菌群差异明显，双胞胎B 在诊断为NEC 前1 周肠道菌群多样性大幅下降，且变形杆菌丰富度增加，约70%，而双胞胎A肠道菌群主要以梭菌和杆菌为主。除了以粪便为基础的研究外，最近一项对疾病部位的甲醛固定石蜡包埋组织的分析也发现，与自然隔离穿孔对照组相比，NEC 病儿中γ-变形杆菌的相对丰度较高，平均升高50%，厚壁菌门和拟杆菌的相对丰度较低，平均降低了15%，微生物多样性更低。

由于早产儿不成熟的免疫系统和经常留置生命支持装置，故早产儿的肠道菌群与足月儿相比主要以肠杆菌科、弧菌科和假单胞菌科的革兰阴性杆菌居多，故更易感染NEC。此外，早产儿肠道菌群还含有更多的潜在致病菌，如大肠杆菌、葡萄球菌和克雷白杆菌。研究表明，长期接触抗生素，特别是氨基糖苷类抗生素，可以使早产儿肠道微生物群落的Alpha 多样性降低，并增加γ-变形杆菌的丰富度。董琳研究发现早期经验性使用抗生素的早产儿，肠道内双歧杆菌数量明显减少，NEC 发生率增高。另一方面，肠道内微生物多样性高、双歧杆菌丰度高的早产儿可能不容易发生NEC。

如果微生物失调是导致NEC 发展的原因之一，那么改变早产儿的胃肠微生物群落，将早产儿胃肠微生物群落转移到更具有保护性的微生物群落，可能会阻止NEC 的发展。总之，建立一个含有多种共生菌的健康胃肠微生物群落对宿主是极其重要的。

NEC 的发生几乎总是在产后1 周后，从不发生在妊娠期，并且NEC 手术病人发现肠壁内存在细菌侵袭，以及无菌动物难以诱导NEC 病变，都凸显了细菌在NEC 发病中的作用。肠道的健康取决于免疫细胞、宿主细胞和肠道菌群之间的良好平衡，肠道菌群不仅参与机体的代谢和能量储存，并在建立免疫系统、抵抗病原菌过程中发挥重要作用，种类繁多的肠道微生物群组成机体肠黏膜系统，可以阻止致病菌对上皮细胞的黏附和定植，有助于预防肠道被感致病菌侵袭感染。人类肠道拥有模式识别受体（patternrecognitionreceptor，PRRs），其能够特异性识别微生物相关分子模式（microbe-associatedmolecularpatterns，MAMPs），并通过支持细胞生长和增殖、细胞保护、调节屏障功能和抗菌肽的分泌来维持小肠稳态，有助于减少病原菌对肠黏膜的黏附、预防肠道感染、调节免疫反应。关于PRRs 如何识别细菌产物，其中研究最多的是Toll 样受体（TLRs），TLRs 可识别MAMPs，此外，机体对G-菌脂多糖可产生固有免疫反应，其中包括脂多糖配体Toll 样受体4 的激活（TLR-4），Toll 样受体4（TLR-4）在NEC 的发生发展中起着重要作用，TLR 4 的表达水平通常在妊娠期间逐渐下降，因此早产儿TLR 4水平较高，早产儿肠道菌群定植不成熟，肠道菌群往往以变形杆菌门为优势菌，变形杆菌脂多糖成分诱导TLR-4激活后，可通过诱导MAMPs激活特定的TLRs，开启特异性免疫反应，通过激活转录因子NF-κβ 启动炎症级联反应，反过来引起肠上皮细胞凋亡和炎性因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、INF-1）的释放，更容易引起细胞因子介导的肠系膜血管炎症，破坏肠道免疫功能，造成肠组织局部缺血坏死，其中促炎细胞因子IL-8，可增加中性粒细胞的趋化性，进一步加重炎症、组织损伤和NEC。Hui 等发现在孕周在28～29周的NEC病儿肠切除标本中促炎细胞因子增加及TLR 4表达增强。肠道共生菌可通过阻止TLRs 对肠道的识别或通过阻断NF-κβ 抑制剂的降解而下调NF-κβ 通路，诱导抑菌肽分泌，限制炎症反应，促进肠黏膜修复。除了TLR 4 通路，其他的途径和细胞类型被认为在NEC的发展中很重要，包括血小板活化因子和Smad7 抑制蛋白途径。其中血小板活化因子是一种潜在存在于各种组织中磷脂炎症介质，其激活可导致胃肠上皮细胞损伤、凋亡、黏膜通透性增加、紧密连接受损以及血管收缩，破坏胃肠道屏障功能；
脂多糖通过诱导Smad7 抑制蛋白中断转化生长因子（TGF-β）信号表达和增强巨噬细胞NF-κβ 介导的炎症反应，并且在NEC标本中发现Smad7表达增强。

试验报告表明，益生菌干预可增强肠道屏障，减轻肠道损伤，抑制肠道菌群失调，显著降低NEC的发病率。唐佳等通过罗伊氏乳杆菌（L.reuturi）DSM17938 菌株对NEC 小鼠模型研究得出，实验组通过罗伊氏乳杆菌干预可降低NEC 中炎性因子TNF-α，IL1-β表达，提高肠道GSH含量、SOD抑制率和活力，从而减少肠道氧化应激反应，增强抗氧化能力，减少肠道炎症反应，降低NEC 发病率。除此之外，肠道内细菌可通过其代谢产物调节宿主肠道免疫力。乙酸、丙酸、丁酸等细菌经结肠内厌氧菌酵解产生短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），一方面可以为宿主提供能量，通过激活G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）途径，促进中性粒细胞向炎症部位趋附，诱导分泌白细胞介素-10（IL-10），从而发挥抑制炎症的作用。还可以抑制组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylases，HDACs）途径，减少脂多糖配体TLR-4 的激活，从而抑制中性粒细胞激活，减少TNF-α 释放，起到抗炎作用，降低NEC风险。

因此肠道共生菌的减少、菌群多样性的下降可以导致新生儿胃肠屏障功能下降，将降低肠道上皮细胞对潜在致病菌的防御能力，增加NEC 发生风险；
反之某些益生菌和细菌产物的干预可以减少肠道炎症反应，降低NEC的发病率。

尽管肠道微生物的作用还没有被清楚地了解，但是紊乱的肠道微生物群，似乎会使新生儿有更高的发生NEC 的风险，肠道微生物群变化在预防或促进NEC 的过程中具有保护性或致病性作用。新生儿健康的肠道环境可以帮助他们减少肠道炎症和损伤，尽量避免NEC 发生。肠道微生物组的监测及干预是诊断及预防NEC的一种很有希望的策略。