运动训练诱导自发性高血压大鼠生理性心脏肥大

彭 朋，何瑞波，马 刚，王大宁，薄 海，秦永生

在20世纪80年代末之前，临床医师一般建议心力衰竭患者要尽量避免体育锻炼。然而研究发现，长期运动训练可改善心血管疾病危险因素，如降低血压水平及胰岛素抵抗。Emter等证实，低强度运动训练显著延迟自发性高血压心力衰竭大鼠模型失代偿性心力衰竭的发生，并提高存活率。更为重要的是，上述运动的健康效应并不依赖于血压的变化。临床研究也证实，心力衰竭患者在医务监督下进行运动训练是安全有益的。

心脏肥大是心脏对各种刺激的适应性反应。病理性刺激，如高血压和心肌梗死导致病理性心脏肥大，后者作为主要心血管病危险因素之一，是几乎所有心力衰竭患者预后不良的体征。然而，长期规律运动训练同样可诱导心脏肥大，但心功能增强同时不会发生心力衰竭，该类型称为生理性心脏肥大(即运动员心脏)。本研究旨在探讨长期运动(游泳)对自发性高血压大鼠(spontameacsly hypertensive rats,SHR)心脏肥大的影响并探讨其可能机制。

1.1 实验动物与分组 30只12周龄SPF级雄性SHR，体重(210±12)g，标准饲料喂养(5只/笼)，12/12 h昼夜交替，自由进食水。动物适应环境1周后随机分为高血压运动组(SHR-exercise，SHR-Ex)和高血压对照组(SHR-control，SHR-C)，将15只健康Wistar大鼠作为正常血压对照组(normotensive control，NC)。SHR-Ex组进行8周游泳运动，SHR-C组和NC组在鼠笼内安静饲养。动物适应1周后开始正式实验。

1.2 大鼠游泳运动方案制定 SHR-Ex大鼠进行每天1次、连续90 min的无负重游泳运动。游泳缸体积为150 cm×60 cm×70 cm，水温30～32 ℃，水深60 cm，保证每只大鼠有200 cm活动面积以进行持续运动。每周训练5 d，共持续8周。方案参考文献[6]。

1.3 血压和心脏超声测定 末次训练后48 h(避免急性运动的影响)，称重后麻醉动物，采用智能无创血压测试仪(BP-2010E，日本)测量尾动脉血压，包括收缩压(systolic blood pressure，SBP)和舒张压(diastolic blood pressure，DBP)。采用7 MHz探头的二维M型超声心动图(Vevo 770，加拿大)对大鼠心脏结构与功能进行监测，参数包括：左心室舒张末期直径(left ventricular end-diastolic diameter LVEDD)、左心室收缩末期直径(left ventricular end- systolic diameter，LVESD)、左心室壁厚度(left ventricular wall thickness，LVWT)和左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.4 组织取材 超声测定后处死大鼠，取出心脏并分离左心室，称重左心室质量(left ventricle weight，LVW)并计算与胫骨长度(tibia length，TL)的比值作为心脏质量指数(left ventricle weight index，LVWI)以评估心脏肥大。心脏分离左心室，沿纵轴将其分为两份，一份用甲醛溶液固定，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)和Masson染色后进行光学显微镜观察，一份投入液氮中并转入-80℃低温冰箱冻存待测分子生物学指标。

1.5 心肌病理学检查 取心肌组织，用10%甲醛溶液固定，经脱水、透明、包埋和切片(5 μm)等一系列处理后制作病理组织切片。HE染色和Masson染色后光学显微镜(奥林巴斯BX51，日本)下选取10个视野，用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测量分别获取心肌细胞横截面积(cross-sectional area，CSA)和胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)，其中CVF为胶原面积与所测视野面积的比值。

1.6 Western blot检测蛋白表达量 将心脏组织匀浆裂解(4 ℃，20000 g离心30 min)，用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。取10 μg蛋白样品经15% SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，一抗4 ℃孵育过夜，包括心钠素(atrial natriuretic factor，ANF)、肌球蛋白轻链-2(myosin light chain-2，MLC-2)、钙调神经磷酸酶Aβ亚基(calcineurin Aβ，CNAβ)、PI3激酶p110α亚基[PI3-K(p110α)]，磷酸化Akt(p-Akt)。以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育1 h，充分洗涤后，使用ECL发光显影，X线胶片压片曝光，扫描各条带的灰度值，β-actin为内参蛋白。以各组与NC组的比值作为蛋白相对表达量。

2.1 一般情况 实验过程中，由于拒跑2只、死亡5只，共剔除7只大鼠，死亡原因主要是高血压大鼠发生心力衰竭以及运动后的感染，最终纳入38只，其中NC组15只、SHR-C组12只和SHR-Ex组11只。

2.2 心脏重量以及血压的比较 与NC组比较，SHR-C组和SHR-Ex组LVW、LVWI、SBP和DBP均升高(<0.05)；
与SHR-C组比较，SHR-Ex组LVW和LVWI增加(<0.05)，SBP和DBP的变化无统计学差异(>0.05，表1)。

2.3 心脏结构与功能的比较 与NC组比较，SHR-C组LVWT升高(<0.05)，LVEDD下降(<0.05)，LVEF的变化无统计学意义(>0.05)；
与SHR-C组比较，SHR-Ex组LVEDD和LVEF增加(<0.05)，LVWT的变化无统计学意义(>0.05，表2)。三组间LVESD的变化无统计学意义(>0.05)。

2.4 心肌染色以及各组CSA和CVF的比较 心肌HE染色见图1，细胞质染成红色，细胞核染成蓝色，NC组大鼠心肌细胞形态和结构正常完整、排列规则有序，SHR-C组心肌细胞肥大肿胀，排列疏松紊乱，SHR-Ex组心肌细胞较SHR-C组排列致密有序，病理学明显改善。心肌Masson染色见图2，心肌间质胶原纤维染成蓝色，NC组细胞间质仅有极少量胶原纤维，SHR-C组可见明显心肌间质胶原沉积以及心肌纤维化，SHR-Ex组心肌纤维化程度较SHR-C组明显减轻。与NC组比较，SHR-C组心肌细胞CSA和CVF升高(<0.05)；
与SHR-C组比较，SHR-Ex组心肌细胞CSA升高(<0.05)，CVF下降(<0.05,表3)。

2.5 心肌胚胎基因表达的比较 与NC组比较，SHR-C组ANF和MLC-2蛋白表达量上调(<0.05)；
与SHR-C组比较，SHR-Ex组ANF和MLC-2蛋白表达量下调(<0.05,表4)。

2.6 心脏肥大信号途径蛋白表达的比较 与NC组比较，SHR-C组CNAβ、PI3-K(p110α)和p-Akt蛋白表达量上调(<0.05)，提示病理性心脏肥大与CNAβ和PI3-K(p110α)/p-Akt两条信号通路激活均有关联；
与SHR-C组比较，SHR-Ex组CNAβ蛋白表达量下调(<0.05)，PI3-K(p110α)和p-Akt的变化无统计学意义，说明运动在不干扰PI3-K/Akt信号通路的情况下抑制钙调神经磷酸酶过表达(图3，表5)。

本研究采用压力超负荷致心肌病理损伤的实验模型，探讨耐力训练(游泳)对心肌的影响，结果发现，长期运动训练能够从结构、分子和功能水平上诱导高血压引起的病理性心脏肥大向生理性心脏肥大转化，这一作用至少发生在高血压心力衰竭代偿期。Emter等以心力衰竭大鼠为研究对象并得到相似的结论，即低强度运动训练诱导心脏出现有益适应并可延缓SHR失代偿性心力衰竭的发生。但过度运动则可对心脏重塑和心功能产生不利影响。普遍认为，运动训练有助于保护个体免受各种心血管疾病的侵袭，但生物学机制尚未完全清楚。值得注意的是，在本研究中，耐力训练在不改变血压水平的情况下发挥了心脏保护作用，这与之前的多项报道一致。

压力超负荷与耐力训练引起的心脏肥大在心脏结构和功能水平上截然不同。病理性心脏肥大的特征是心肌纤维化、血管形成减少、细胞凋亡增加、胚胎基因重新表达、代谢(尤其是脂肪酸代谢)基因表达下调、左心室功能障碍及病死率增高。生理性和病理性心脏肥大均存在心脏几何结构的改变，压力超负荷常发生向心性肥大(心室壁增厚，心腔缩窄)，而容量超负荷则表现为离心性肥大(心室壁与心腔成比例增加)。耐力训练如长跑或游泳一般诱导心脏离心性肥大。尽管生理性和病理性心脏肥大之间的差异得到广泛证实，但这两种形式的肥大是否由细胞内不同的信号转导途径引起尚不清楚。由于病理性心脏肥大的刺激通常是慢性的，而生理性心脏肥大的刺激则是间歇性的，因此刺激的持续时间被认为是决定心肌表型的关键。但在Perrino等设计的间歇性压力超负荷小鼠模型中证实，决定心脏肥大类型的主要因素是触发和激活的细胞内信号通路的种类，而非持续时间。

目前，在生理性和病理性心脏肥大中发挥不同作用的2个信号转导通路已被确定，分别是PI3-K/Akt通路和钙调神经磷酸酶通路。本研究结果证实，耐力训练能够在不干扰PI3-K/Akt通路的情况下恢复钙调神经磷酸酶活性。由于钙调神经磷酸酶介导病理性而非生理性心脏肥大，因此推测长期运动训练通过抑制病理性心脏肥大信号途径改善SHR心脏重塑。钙调神经磷酸酶是一种钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，可使活化T细胞核因子(calcineurin/nuclear factor of activation T cell，NFAT)去磷酸化，进而促进其核转位并上调心脏促肥大基因和胚胎基因表达。心肌过度表达钙调神经磷酸酶或NFAT3的转基因小鼠易发生心肌梗死，并迅速发展为心力衰竭。相反，CNAβ缺陷小鼠对病理性刺激如压力超负荷、血管紧张素Ⅱ灌注产生肥大反应的能力明显受损。PI3-K/Akt途径是参与出生后心脏正常生长的主要信号通路之一，其上调已被证实可诱导生理性和病理性心脏肥大。心脏肥大表型与Akt上调的程度有关，过度刺激该通路将导致病理性心脏肥大。此外，PI3-K/Akt通路通过在多种机制抑制凋亡并促进细胞存活。本研究发现，耐力训练仅下调钙调神经磷酸酶介导的信号途径，而对PI3-K/Akt通路并未产生作用，提示运动训练是病理性心脏肥大安全有效的防治策略。

胚胎基因(ANF、MLC-2)是胚胎时期心脏表达的、进入成年后则处于静止状态的基因。临床研究证实，循环ANF水平增加与心力衰竭的严重程度呈正相关。由于胚胎基因表达的胎儿型蛋白质功能低下，因而造成心脏表型由成熟的“收缩状态”向“胚胎型合成状态”转变，继之造成病理性心脏肥大。在本研究中，游泳训练使ANF、MLC-2蛋白表达量得以下调，提示运动训练有可能通过下调胚胎基因表达抑制病理性心脏肥大，这对于恢复SHR受损的心功能具有重要作用。

综上所述，长期运动训练能够促进SHR病理性心脏肥大向生理性心脏肥大转变，其机制可能与钙调神经磷酸酶信号途径活性下调及胚胎基因表达下调有关。