移液工作站在兽医检测工作中的应用

杨得胜，孙荣钊

（1.福建省动物疫病预防控制中心，福建福州 350003；
2.青岛立见生物科技有限公司，山东青岛 266032）

随着各行业对动物疫病防控认识程度的不断加强，监测数量不断增加，检测的精准化和通量化要求也迅速提升，自动化技术也逐步应用于实验室工作。兽医实验室监测工作，主要包括血清学抗体和病原学核酸等检测项目。这些项目需要进行精确移液，而自动化工作站将已经成熟的工业自动化控制技术与液体移动技术相结合，越来越广泛地被应用到兽医实验室检测工作[1]。本文就血清抗体检测和病毒核酸检测工作中使（试）用的工作站进行评估，以期建立更高精度、高通量的抗原抗体检测“标准化+全面质量管理”标准操作流程。

运用血清学检测技术开展免疫抗体监测，可评估免疫效价是否可靠，免疫方式是否有效，免疫程序是否合理等。血清学监测是动物疫病监测预警的重要手段之一，通过定期、分阶段、分群体地对养殖场内动物群体进行血清学监测，可以准确了解监测群体的免疫状况和健康状况，从而制定相应的防控措施，提高免疫效果。同时血清学监测也可进行疫病检测和净化及动物性食品安全监管。目前动物疫病血清学监测常用方法包括酶联免疫吸附试验、血凝和血凝抑制试验、平板凝集试验等，所用的设备多为小型移液站、洗板机等，全流程或半自动化程度整体偏低。

移液工作站在血清学检测中表现出很好的可靠性和稳定性。李军等[2]用RSP 100-BEP Ⅲ自动酶免疫分析系统检测乙肝6 项标志物，发现设备可提高酶免疫分析方法的精密度，减轻劳动强度。付杰等[3]用AddcareElisa800 全自动酶免工作站，以操作简单、检测快速、结果准确等优点，实现了ELISA 分析的自动化、标准化、快速化，避免了人工加样错误，同时也降低了检验人员的感染风险。张鹏等[4]使用Freedom EVO 150 全自动酶免工作站与人工操作比较检测养殖场的4 种禽病，确定了工作站的可靠性和稳定性。

目前，市场上的自动化工作站品目繁多（表1），各类型机器并非单一功能，用户在熟悉使用工作站时应充分挖掘其性能。如B 品牌（以下产家均用代码简称）的高通量洗板机可兼具实现用塔架完成30～50 块硬质90 度板的快速分液，分液的最低量可达1 μL，同时兼具洗板和高精度分液的使用。虽然单块板分液速度平均约为12 s（人工约15 s），但分液持续性和稳定性却优于人工操作。该设备的低容量5 μL、20 μL 等分液头因分液头过于精细，容易造成喷口堵塞，特别是血凝/血凝抑制试验中使用容易沉淀的红细胞时，因此低容量分液头对试剂有一定要求。T 品牌的高通量洗板机也可实现高达50 块板的自动分液和洗板，但其最低分液量只有50 μL，适合ELISA 的各种分液，并不适合应用于血凝/血凝抑制试验。如果将分液头升级为96通道，其3 遍洗板的平均时间约为50 s，相对于8通道3 遍洗板的时间180 s，对于批量化监测工作可以大大缩短时间。相对进口产品，国产设备的优势在反馈和模具调整及时。如深圳L 品牌的全自动微量分液器不仅能适用于标准的ELISA 板、硬质90 度V 型板，对不规则的软质90 度V 型板也专门配备专用基座，对基层的使用更方便，在稍作改造和编程后，也能完成平板凝集试剂的快速分液（图1）。

图1 平板凝集实验中检测试剂快速分液

表1 动物疫控系统较常用血清学检测相关设备

对于移液工作站而言，H 品牌工作站与T 品牌工作站两者的工作原理不同。H 品牌工作站使用的为石墨枪头，具备电容式液面探测（cLLD）功能，另有压力式液面探测（pLLD）功能，管道中采用空气置换原理，可监控空气置换情况，实现通道吸放液全程监控。T 品牌工作站的电导枪头也为石墨型，但其通过空气传导或液体传导测量压力差来感知页面高低。H 品牌工作站能感知泡沫、液体等变化差，敏感性高，移液棒可兼具小抓手功能，相对于T 品牌工作站的专业抓手来说更节省经费，在小型工作台上具有一定优势。但H 品牌工作站的台面为平面型，可使用的一般为5×5 型或5×6型平面，对需使用大量枪头的工作来说并不方便。T 品牌工作站的台面为立体型，除了3×3 型平面，设备的后方还可加载7 层常温塔架、37 ℃控温塔架或其他规格塔架，在使用钢针的情况下，可实现不同任务的批量动物疫病ELISA 检测。实际工作中，用户应根据实际需求选择所需设备（表2）。

自动移液工作站在法医、医院、科研部门均得到了广泛应用。刘冰泉等[5]用Freedom EVO 150-8 型核酸提取及PCR 体系构建工作站提取血液中的DNA，稀释2～32 倍的血样本，采用工作站和Chelex-100 法的检验成功率均可达到100%；
稀释64 倍的样本，Chelex-100 法成功率为41.3%，完整分型数为78.3%，自动化工作站成功率为13.0%，完整分型数为43.5%，两者比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。姜先华等[6]应用Freedom EVO 150 工作站开展批量血斑STR 分型研究，发现自动化工作站批量检测方法在成功率、稳定性、均一性等方面具有优势。王大明等[7]使用Tecan工作站相比较于Gentra法和胍盐酸法全血用量少，价格比较便宜，适合大批量全血样本抽提基因组DNA，且工作站提取基因组DNA 适用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物学试验。王淼[8]用Beckman 的自动化工作站评估了不同核酸提取方法的效果，显示全自动提取核酸处理大批量样本，不仅省时省力，降本增效，且减少化学试剂对工作人员的影响。

动物疫病病原学监测中，常用的方法是病原核酸检测，现有的主要操作步骤集中在核酸提取过程和扩增体系构建。传统核酸提取方法中包含的沉淀、离心等步骤较为繁杂，费时长，实现自动化操作难度较高，且不适合大批量样本的核酸提取；
在工作过程中，人员还需直接接触有毒的化学试剂。近年来，磁珠法核酸提取法的出现，大大优化了操作体验。磁珠法与非磁性核酸提取方法相比较，磁珠法除了节省时间，防止人员伤害以外，最突出的优势就是易实现自动化，防止交叉污染。国内外也制造了很多相关的自动化核酸提取仪器及配套试剂（表3），如西安天隆的GeneRotex、NP968-S和NP968-C，北京天根的TGuide S96、TGuide S32 和TGuide M16，杭州博日的GenePure Plus/Pro 和GenePure Pro 96/T，ROCHE 的Magna Pure LC，ABI 的Magmax，Qiagen 的EZ1、QIAcube和Biorobot，Thermo 的Kingfisher，Eppendorf 的epMotion 5075 等设备，减少了核酸提取过程的人工参与。与一些厂家将磁珠法和自动化工作站整合，升级为核酸提取和体系构建自动化系统以实现非人工介入的大规模样本处理，如西安天隆的PANA9600S，Qiagen 的QIAsymphony SP/AS，Backman 的Biomeck3000、Biomeck FXNX。但目前能较好整合各类仪器设备实现全流程自动核酸提取、PCR 反应体系构建、（荧光）PCR、自动电泳的暂时只有帝肯Tecan 的EVO 系列和哈密尔顿Hamilton 的STAR 系列。

表2 动物疫病血清学检测快速移液工作站配置方案

3.1 在动物疫病检测中的优势

3.1.1 结果准确 自动化工作站按照设定好的程序自动进行试验，不会出现由于人员疲劳或分神导致的错误。目前各类移液工作站在10 μL 容量允许误差≤±6%，测量重复性≤3%；
25 μL 容量允许误差≤±3%，测量重复性≤1.5%；
100 μL 容量允许误差≤±2%，测量重复性≤1%。但在使用过程中也应不定期核验数据，定期开展仪器的校准工作和设备的期间核查，减低系统误差。

3.1.2 操作稳定 主要表现在设备运行过程完全按设定的时间和步骤进行，全程电脑控制，无需人员干预。其次是工作站需要的很多耗材和试剂是配套产品，出厂时已完成模块化生产和预装配，实验室购入后不需要人员再预分装，使用前仅需除去外包装放入机器即可，减少了人员干预过程，降低了不稳定因素。卢婷[9]用酶免工作站与全自动化学发光免疫分析仪共同检测HBV 血清学标志物时，发现两者的结果一致性很好，检测总符合率≥98%，Kappa 检验系数K均大于0.96。

3.1.3 运行高效 自动化工作站可完全按设定好的程序，实现无人值守工作，提高实验室工作效率。

3.1.4 安全性高 工作站减少了人员接触潜在感染性样品和检测化学试剂的风险，提高了检测人员的安全性。

3.2 移液工作站在动物疫病检测中的不足

3.2.1 对样品的处理要求高 移液工作站的管道设置、移液头、多通阀和蠕动泵等均为精密配件，如血清中的絮状物、脂肪凝集块等被吸入管道均会使设备停摆，甚者造成配件损毁。因此，在使用工作站时应做好样品的前处理，放入机器前应认真检查样品状态。

表3 动物疫控系统较常用核酸检测相关设备

3.2.2 价格较为昂贵 一是小型的工作站起步价十余万，大型工作站或联动工作站更加高昂。二是耗材成本较高，很多工作站的耗材多为封闭式，无法开源生产，推高了使用成本。以石墨枪头为例，其石墨导电枪头单支价格达到1 元，远超其他PFA 或PP 材质的移液枪头，但也有用特殊洗液清洗固定钢针的办法来代替石墨枪头开展检测。如加拿大皇家骑警在3 年内用次氯酸溶液清洗Tecan 工作站固定钢针的核酸提取方法对15 000 名嫌疑人DNA 进行STR 分型，未发生交叉污染[10]；
北卡罗来纳大学的Ditter 实验室对癌症相关基因研究过程中，使用清洗固定钢针的方法进行qPCR 体系构建工作，也未发生交叉污染[11]。经次氯酸溶液处理钢针能有效避免交叉污染，但大量次氯酸的使用则给试验后期的环保处理增加了压力。

3.2.3 维护有难度 工作站与操作人员需要较长时间磨合，才能实现良好的人机互动。工作站的每个操作节点均需提前设置，以Tecan 工作站为例，其移液高度、排液速度、液面感应、管道压力选择等均要细化，软件编程、修改和机械臂定位需要长时间培训，检测实验室如无专人进行维护则外包维护成本激增，且后期需拓展新的移液项目困难，同时联动仪器越多的工作站维护难度及成本也就越高。

3.2.4 校准检定困难 因操作复杂，很多移液工作站在校准时需单独编程移液，而第三方校准服务公司因不会使用工作站而无法开展校准检定，因此多数工作站均只能由厂家出面进行调校，这对量值溯源有要求的检测工作有一定影响。

3.2.5 试剂损耗增加 理论上移液工作站的试剂损耗在较小范围内，但在实际中，由于无液面探测的移液枪头蘸取、无盖蒸发、管道冲洗等原因，造成的试剂损耗相比手工操作会偏高，因此需要操作人员不断优化流程，实现工作最优化。

除了现有检测工作的精细化程度不断提升外，基层兽医实验室人员老化也严重，部分人员视力、精力跟不上日常精细检测工作的需求，因此基层实行自动化或半自动将是兽医实验室今后硬件设备发展的趋势。实现全流程自动化的需求目前在基层兽医实验室很难实现，但可以将部分检测步骤自动化。目前进口设备在很多领域的技术性能仍优于国产品牌，但国产的自动/半自动移液工作站也在逐步发力。谢志豪等[12]设计的工作站滴定精度小于1 μL，定位精度≤10 μm，重复精度≤15 μm。李晶等[13]设计的200 μL 移液模块用蒸馏水进行测试，在70～150 μL 时CV 小于0.75%，对比吸液理论数据和实测数据，验证此移液模块的精度符合设计和使用要求。刁保卫等[14]建立了适合于微生物实验室以及分子分型实验室的高通量的自动化PCR 体系配置与PCR 产物纯化系统，与使用96 孔PCR 板手工操作相比，使用384 孔板利用自动液体工作站完成相同的PCR 体系配置工作，效率能够提高2.5 倍，显示了较好的应用前景。工作站逐步代替人工的趋势渐渐形成，兽医实验室工作也正在向自动化方向发展，可以预见，自动化移液工作站将会被越来越广泛应用于动物疫病监测工作中。在使用进口产品的同时，也应大力支持国产设备的发展，实现国产设备内外双循环良性发展。