ＩＧＦ－１Ｒ抗体对兔耳瘢痕组织的影响_瘢痕组织

　　作者：陶芸，赵亚南，王继华，张景波，肖鸿，刘红莉 　　[摘要]目的：观察胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)抗体对兔耳增生性瘢痕组织的影响。　方法：建立兔耳增生性瘢痕动物模型，21天后瘢痕局部注射不同浓度的IGF-1R抗体或生理盐水，连续7天，观察1个月。分别对瘢痕增生指数(hypertrophicindex，HI)、成纤维细胞数和胶原含量的变化进行比较。结果：一定剂量IGF-1R抗体组HI值、成纤维细胞数量以及胶原含量比对照组减少(ρ＜0．01或0．05)。　结论：IGF-1R抗体能抑制兔耳瘢痕组织增生。
　　[关键词]胰岛素样生长因子-1受体；增生性瘢痕；动物模型
　　[中图分类号]R619+．6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2006)12―1334―03
　　[基金项目]云南省教育厅科学研究基金项目(04J876C)
　　通讯作者：赵亚南，男，教授，主任医师，硕士研究生导师。
　　E-mail：yzha04@hotmail．com
　　
　　伤口愈合后期成纤维细胞增殖及合成、分泌旺盛，引起细胞外基质过度沉积导致增生性瘢痕的形成。生长因子持续刺激是创伤愈合后瘢痕增生的原因之一，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)能促进细胞分化，又与成纤维细胞增殖、活跃程度密切相关，是影响创面愈合的重要因子之一。近年来研究发现，增生性瘢痕中大量表达IGF-1及其受体，并认为可能与瘢痕的形成密切相关。本研究即利用外伤性兔耳早期瘢痕增生模型，观察并研究IGF-1R抗体对增生性瘢痕组织的影响，初步探讨IGF-1及其受体与瘢痕增生的关系。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1试剂及仪器：IGF-IR抗体购自深圳晶美生物制品有限公司。XSB211型OLYMPUS光学显微镜、TD-2000真彩色病理显微图像分析系统和LEICA RM2145超薄切片机由昆明医学院重点实验室提供；LEICA DM 6000B病理图像分析仪由云南药物研究所提供。
　　1．2实验动物：健康日本大耳白兔20只，雌雄各半，体重
　　2．2～2．6kg，购自昆明医学院动物实验中心。
　　1．3实验方法
　　1．3．1动物模型的建立：兔适应性喂养72h，用3％戊巴比妥钠(1ml／kg)耳缘静脉注射麻醉。在兔双耳腹侧部分沿长轴避开可见血管，分别做6个直径1．0cm的圆形切口，切口间隔1．0cm，完整切除全层皮肤，去除软骨膜，用热金属丝点灼创缘皮肤，至轻微结痂，达到充分止血，术毕创面用无菌纱布包扎固定。每只兔12个创面，共240个创面。术后一周去痂，自然愈合。术后21天左右，约有90％的创面形成外观凸起的瘢痕组织，随机取样，病理证实为外伤性早期兔耳瘢痕增生。
　　1．3．2动物组别和处理：兔耳瘢痕模型制作成功后，随机将每只兔耳的8个瘢痕块分为4组：生理盐水溶剂对照组(A组)、IGF-1R Ab 1．5μg／ml剂量组(B组)、3．0μg／ml剂量组(C组)和6．0μg／ml剂量组(D组)，共20只兔，故A～D组各有瘢痕块40个。术后第21天，分别对各组瘢痕基底部及瘢痕灶内注射不同浓度的IGF-1R抗体或生理盐水，每日注射1次，持续7天，每次注射用量为20μl。
　　1．3．3标本取材及处理：用药后第3、7、11、20、30天，在同样的麻醉条件下切取瘢痕组织及周围正常组织标本于10％福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，行苏木素一伊红染色(HE)和胶原染色(VG)。光镜下观察HE染色切片，用测微尺测出瘢痕最高点至耳软骨表面的垂直厚度(a)、瘢痕周边正常皮肤至耳软骨表面的垂直厚度(b)，测算出瘢痕增生指数(hypertrophic index，HI=a／b)。每张组织切片分别随机选5个不重叠视野(×200)，HE染色切片镜下目测计数成纤维细胞数、VG染色切片定量检测胶原面密度的变化。
　　1．3．4统计学处理：实验结果用x±s表示，采用SPSS11．5软件包做统计学分析。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1形态学观察：兔耳腹侧形成创面后，伤口约13～16天愈合，上皮化时即能触到硬块，此硬块不断高于皮肤，21～23天时增生达到高峰，厚度约为兔耳腹面正常皮肤厚度的2-3倍，质硬，色红。实验末期生理盐水对照组瘢痕仍维持较明显的增生状态，充血明显呈紫红色，质硬；B～D组瘢痕均出现萎缩，表现为瘢痕体积减小，充血减轻，变平变软、色泽变浅，其中C、D组最为明显。
　　2．2组织学观察
　　2．2．1 HE染色切片：与正常的兔耳全层结构相比，生理盐水对照组和B-D组瘢痕组织均厚于正常组织，尤其生理盐水对照组，可厚达正常组织的3倍，表皮呈波浪状明显增厚。实验组软骨有明显的增生，炎性细胞较多，成纤维细胞核大、增生旺盛，毛细血管增生明显，胶原纤维粗大，排列紊乱。瘢痕浅部可见环形或漩涡状分布，深部则平行排列于软骨，软骨增生明显。B～D组瘢块内成纤维细胞减少、核变细小，胞质减少，瘢痕厚度较薄，可见少量毛细血管；以C、D组明显(图1、2，见中插1)。
　　2．2．2 VG染色切片：对照组胶原纤维呈红色，细胞颜色浅灰，散在分布于胶原纤维问。与对照组比较，C、D组的胶原纤维染色较淡，较为疏松，纤维排列较为规整(图3，见中插1)。
　　2．3瘢痕增生指数：各组在不同时相点的HI值结果见表1，B～D组HI值随时间延长逐渐降低而A组则逐渐升高，C、D两组各时间点均比生理盐水对照组降低(ρ＜0．01或0．05)。
　　2．4成纤维细胞计数和胶原面密度测量值：见表2、3。结果显示：与A组比较，C、D组成纤维细胞和胶原面密度减少非常明显(ρ＜0．01)，B组与A组比较差异无统计学意义。
　　
　　
　　3　讨论
　　
　　增生性瘢痕是整形外科基础研究的重要课题之一，研究发现多种细胞因子在瘢痕形成中起作用，其中IGF-1及其IGF-1R介导的信号通路对瘢痕形成可能起着十分重要的作用，能够诱导体外培养的成纤维细胞合成和分泌胶原等胞外基质，影响创面愈合后组织的改建。体外实验表明，生理浓度的IGF-1即可有效抑制成纤维细胞的凋亡，维持细胞的生存；IGF-1R激活后还可上调许多细胞因子如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等表达，促进细胞增殖和创面愈合后瘢痕的形成。Ghahary等研究发现，IGF-1能降低烧伤后增生性瘢痕中成纤维细胞合成胶原酶mRNA的水平和胶原酶的活性。Ishihara检测到增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的成纤维细胞大量表达IGF-1受体，并且认为由此抑制了细胞凋亡的发生或打破了细胞增殖和凋亡的平衡，进而使得细胞外基质大量表达和沉积。
　　严重炎症或伤口愈合延迟等原因将会导致增生性瘢痕的形成，增生性瘢痕以排列不规整、漩涡状或团块状的胶原大量沉积和旺盛增生的成纤维细胞为特征。虽然对这种改变的生物机制尚不清楚，但已发现病变部位胶原合成明显高于 正常皮肤，而成纤维细胞则是胶原生成的主要来源。因此，能调控成纤维细胞的增生或增殖，将会明显减轻瘢痕的增生，改善创面的修复。近年来有关IGF-1及IGF-1R的研究认为，IGF-1具有促进成纤维细胞分泌、产生纤维性蛋白的作用，并能促进皮肤的成纤维细胞产生纤维粘连蛋白、1型前胶原的前a1(Ⅰ)链和Ⅲ型前胶原的前al(Ⅲ)链的mRNA表达增加。IGF-1的功能主要靠与IGF-1受体结合来介导完成，别的生长因子如血小板生长因子(PDGF)和表皮生长因子(EGF)及其受体可诱导产生IGF-1又能增加IGF-1连接位点的数量，还采用IGF-1自泌途径来刺激细胞增殖，甚至PDGF、EGF受体的促分裂作用和转化潜能也可能与IGF-1R有关。靶向破坏EGF受体或PDGF受体时，可使细胞在一定程度上得到抑制，但有些细胞通过表达IGF-1R，这种抑制作用可得到阻止，生长作用得以恢复。阻断IGF-1R，便能下调其他生长因子受体的表达，因此，通过靶向破坏IGF-1受体或受体基因比破坏其它生长因子或受体基因对细胞的生长抑制作用更彻底。
　　从对兔耳增生性瘢痕的研究看，局部注射一定浓度外源性的IGF-1R的抗体能有效减轻瘢痕增生的程度，使其变软变平，颜色变浅，瘢痕增生指数也明显降低。另外，通过HE和VG染色观察到，与对照组A组比较，注射后第三天B、C和D组的成纤维细胞计数和胶原纤维面密度开始降低，并且持续到第30天，但只有C和D组的降低与对照组比较有显著性差异。说明兔耳瘢痕生长过程中，IGF-1R抗体可能阻断了IGF-1与IGF-1R的结合，直接抑制成纤维细胞的生长增殖，从而减少胶原的合成、分泌；另外，可能通过胶原酶的增加、胶原酶活性的增强，促使已形成的胶原纤维降解、重吸收，减轻瘢痕组织的增生。
　　本实验中能较长时间抑制瘢痕的增生，除了IGF-1及其受体的作用受影响外，还可能阻止了别的生长因子如EGF、FGF及其受体与IGF-1R的协同作用的发挥，进一步抑制了IGF-1的促成纤维细胞增殖和促瘢痕增生的作用，改变了增生性瘢痕持续增生的状态。
　　应用兔耳增生性瘢痕模型，观察阻断IGF-1与其受体的结合对增生性瘢痕的抑制作用，较体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞进行的相关实验真实可靠，为人类增生性瘢痕机制的研究提供了理论和实验依据。但IGF-1及IGF-1R或与其他生长因子及受体对瘢痕增生影响的具体机制还有待进一步的研究。
　　
　　[收稿日期]2006-09-11　[修回日期]2006-12-08
　　编辑／张惠娟
　　
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