不同配比纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合材料细胞相容性的研究|羟基磷灰石复合材料

　　[摘要]目的：观察不同配比nPCL/HA电纺纤维取向薄膜材料的细胞相容性。方法：将人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外诱导培养为成骨细胞；并经传代培养第5代的人骨髓间充质干细胞，以2×105cm2的密度与不同配比nPCL/HA电纺纤维取向薄膜支架在培养板内共培养，同时以nPCL电纺纤维非取向薄膜材料作为对照，初步观察hBMSCs在不同配比nPCL/HA支架材料上复合培养，对其细胞相容性进行评价。结果：hBMSCs与3种电纺薄膜支架材料均有细胞相容性，细胞能在不同材料表面黏附生长、分化增殖。但是PCL/ HA的配比为20:1电纺纤维取向薄膜材料黏附率（35.3±2.6）%，为3中材料中黏附率最高的一种，材料表面细胞生长良好，体积变大，有伪足生长。结论：PCL/ HA的配比为20：1电纺纤维取向薄膜材料，较适合作为支架材料应用于hBMSCs为种子细胞的组织工程构建。
　　[关键词]骨髓间充质干细胞；聚己内酯；羟基磷灰石；细胞相容性
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）02-0243-04
　　
　　Cellular biocompatibility of various electrospunnPCL/HA scaffold materials
　　LI Jia-feng1,WAN Mei-rong2,GUAN Hai-hong1,HE Wen-peng1,ZHANG Hong-chuang1,ZHANG Yang1,CHEN Li-juan1
　　(1.Department of Oral Maxillofacial Surgery, Affiliated Xuzhou City Hospital of Xuzhou Medical College; 2.Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate cellular biocompatibilityof different nPCL/HA scaffold materials.MethodsElectrostatic spinning or electrospinning is an interesting method for producing nonwoven fibers with diameters of submicrometers down to nanometers. Nanofibrous membranes were used in many biomedical applications including drug delivery, wound healing and scaffolding for tissue engineering. Novel bone-scaffolding materials were successfully fabricated by electrospinning from polycaprolactone(PCL) solutions containing nanoparticles of hydroxyapatite(HA). In intro cultured hBMSCs(5th generation) were seeded at the density of 2×105 cell/cm2 onto scaffolds ofnPCL/HA and nPCL as control. The cell-material complex was observed in order to evaluate the cellular biocompatibilitybetween cells and materials.ResultsHBMSCs were shown good adhesion to all 3 types of scaffolds after seeding. The cellular biocompatibilityof nPCL/HA(20:1) (35.3±2.6)% washigher than the others.ConclusionNano-PCL/HA(20:1) was shown significantly higher adhesion rate to hBMSCs, and could be used as scaffold material in the field of bone tissue engineering.
　　Key words:bone marrow stromal cells; polycaprolactone; hydroxypatite; cellular biocompatibility
　　
　　纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合材料是由猪骨提取的羟基磷灰石和聚己内酯交联法获得的。羟基磷灰石是骨组织的成分，纳米级羟基磷灰石（Nano-HA）除了具有传统HA的特性外，在理化性质和生物学方面有更大的优点[1-2]。聚己内酯（PCL）是一种被广泛研究的可生物降解高分子材料，具有良好的生物相容性，且药物通透性好。目前已在很多领域得到应用，尤其是在医疗方面，如胶带、绷带、矫正器、缝合线、药物缓释剂以及组织工程支架材料等。作为一种新复合材料，我们对其生物相容性进行评定，本文主要是评价该复合材料在体外的细胞相容性。
　　1材料和方法
　　1.1 实验试剂和材料 试剂：MSCM（SCICELL），低糖DMEM/ F12（Hgclone,USA），胎牛血清（杭州四季清），淋巴细胞分离液（上海，比重为1.073g/ml），碱性成纤维细胞生长因子bFGF(promege)，人表皮生长因子EGF(promege)，RT-PCR试剂盒（北京天根生物有限公司），倒置显微镜（日本），二氧化碳培养箱，离心机。nPCL/HA电纺纳米纤维（东南大学生物电子学国家重点实验室提供）。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 实验分组：本文所用材料nPCL/HA电纺取向薄膜由由东南大学生物电子学国家重点实验室提供，共有3种，分别是：1号样品含HA比例为PCL:HA是5:1、2号样品含HA比例为10:1、3号样品含HA比例为20:1的乙酸乙酯溶液的电纺取向薄膜；4号样品为一种不含HA的PCL的乙酸乙酯溶液的电纺纤维非取向薄膜作为对照。纳米电纺薄膜的直径约为1～5μm，材料规格约10cm×6cm大小，环氧乙烷消毒后备用。使用时制备成5mm×5mm。
　　1.2.2 人BMSCs的分离与培养：实验所用肝素化的骨髓，来源于研究人员自身骨髓。20ml骨髓血与等量PBS混合，1500rpm、离心10min，弃脂肪和上清层。用PBS重悬细胞，以3:1体积比加入Percoll(1.073g/ml)液面上，3 000rpm、离心25min。取单个核细胞层，用PBS洗遍2次，第三遍用含10%胎牛血清的DMEM/F12洗，接种于MSCM培养基培养瓶，置于37℃、5%CO2箱常规培养。72h后更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，以后每隔3天更换一次培养液。形成多个细胞克隆，传代培养，传至第5代(P5)细胞待用。
　　1.2.3hMSCs向成骨细胞分化的诱导 ：取P5代的MSCs，再更换为诱导液：用含10-7mol/L地塞米松 10-2mol/Lβ-甘油酸钠500μg/L的维生素C的培养液来培养，观察细胞形态变化。
　　1.2.4流式细胞仪：分别取诱导前P5代细胞和诱导后72h的细胞，0.25%胰酶消化后收集细胞,分别加入FITC标记的小鼠抗人CD34、CD45抗体，常温暗室孵育20min，加入PBS 2ml,2 500r/min离心5min，弃上清，加入PBS 500μl混匀后用流式细胞仪检测。
　　1.2.5RT-PCR：分别取诱导前P5代细胞和诱导后72h的细胞，0.25%胰酶消化后收集细胞，做RT-PCR，以高纯度离心柱试剂盒提取总RNA。PCR反应体系为25ul体系，40个循环。引物序列分别为：Ⅰ型胶原蛋白(534bp)：上游5＇-GGTTTGGAGAGAGCATGACC-3＇,下游5＇-TTTGGGGAAATTGA GTTTGG-3＇。扩增产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相。
　　1.2.7复合材料复合细胞培养和粘附实验：本实验将nPCL/HA纳米电纺取向薄膜制备成5mm×5mm大小，环氧乙烷消毒后置于24孔培养板，将传至第5代的人骨髓间充质干细胞以2×105/cm2的密度接种于材料上，静态2h后再加1ml培养基，于37℃、5%CO2培养箱常规培养，培养24h、48h、72h，用倒置显微镜（40×100倍）观察细胞生长及黏附情况。黏附率的测定采用间接计数法计算，具体方法为：将材料取出，用胰酶消化细胞，胎牛血清终止反应，PBS轻轻冲洗，收集细胞；另行将培养板残余细胞消化收集，分别计数，所得结果为未黏附细胞数。材料的细胞黏附率=（总细胞数－未黏附细胞数）/总细胞数×100%。
　　
　　2结果
　　2.1 倒置显微镜下观察：骨髓间充质干细胞分离接种24h后细胞呈半贴壁状态，扁平（图1A），48h后完全贴壁，有“出芽现象”（图1B），72h后细胞呈纺锺状，有伪足生长，加入新鲜培养基后，细胞逐渐形成梭形。7天后细胞逐渐形成集落（图1C），由15～20个细胞融合成，细胞排列有一定的方向性，呈漩涡状排列，象成纤维细胞，培养14天细胞融合80%～100%传代扩增，24h细胞完全贴壁，此时细胞增殖较旺盛，每周扩增一次，共计五次。加入诱导剂培养72h后细胞细胞由单一的纤维状变成立方形三角形多边形，体积增大,细胞表面分泌出颗粒状物质，增殖细胞之间界限模糊，局部细胞可呈复层生长，与成骨细胞有相似的形态和生长特点，最终形成骨结节（图1D）。
　　2.2nPCL/HA材料的扫描电镜检测细胞培养的形态学观察：（见图2）；纤维薄膜呈取向性。
　　2.3 HBMSCs在材料表面生长分化：HBMSCs接种培养于不同配比的电纺薄膜表面后，采用倒置显微镜（40×100倍）下观察细胞在电纺薄膜表面的黏附情况，并据此测算其黏附率。培养24h后，可见不同材料表面黏附细胞数量不一，细胞形态不一。48h后，见不同材料人骨髓基质干细胞紧贴薄膜表面，细胞开始变形，大小形态不一，交错明显，细胞无伪足生长。72h后，3号材料细胞黏附，大小不一，部分细胞伪足生长不明显，部分细胞伪足生长明显，有个别细胞未有伪足生长（图3A）。2号材料MSCs细胞黏附，未见有明显伪足伸展，大小不一。有个别孔隙内细胞黏附，伪足伸展（图3B）。1号材料MSCs细胞生长分布均匀，黏附表面，细胞有伪足生长明显。见细胞形态不一（图3C）。
　　2.4 3种不同材料的黏附率分别为：28.8%±2.5%，24.8%±2.3%，35.3%±2.6%，对照材料49.9%±2.3%。表1中可见，在3号电纺纤维取向薄膜材料的黏附率最高，且与nPCL电纺纤维非取向薄膜材料的黏附率相近，2号电纺纤维取向薄膜材料的黏附率最低。
　　2.4 RT-PCR结果：图像分析结果表明,MSCs的I型胶原mRNA的表达很弱,细胞定向诱导后,I型胶原mRNA的表达明显增强，如图4。
　　2.5流式细胞仪：hMSCs表型鉴定结果:P1骨髓干细胞CD34、CD45荧光强度为9.97和16.10；P5 CD34、CD45荧光强度分别为144.79和237.55 (图5)。
　　
　　3讨论
　　细胞培养法检测材料细胞相容性是一种快速、简便、有效廉价的方法，在材料生物相容性评价中有至关重要的作用。复合材料与细胞在体外培养可以消除体内多种因素的干扰，直接观察细胞在材料表面的粘附、生长和分化增殖情况。研究认为不同组织来源的细胞对材料的敏感度是有差异的[3]。我们用以实验的组织工程材料是骨组织修复材料，因此需选用骨髓来源地细胞或者具备能诱导转化为骨的细胞作为种子细胞，如骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞具有多向转化的潜能，通过生长因子的诱导，最终能分化为成骨细胞，在骨缺损的修复过程中起着重要作用，是当前最适骨组织工程的种子细胞[4]。MSCs在骨髓中的含量并不高，我们通过流式细胞仪检测CD34、CD45的表达很低，经过梯度离心和贴壁培养，P1荧光强度分别为9.97和16.10，经传代、纯化CD34、CD45的表达明显升高，P5荧光强度分别为144.79和237.55，说明在较短时间内可以获得大量种子细胞。另外，分泌Ⅰ型胶原是骨细胞的特征之一，用RT-PCR方法可检测诱导后72h的Ⅰ型胶原mRNA的表达比诱导前明显升高，从分子水平上说明骨髓间充质干细胞可以向成骨细胞分化。研究表明细胞在材料表面的粘附有多种因素，其中主要有材料表面的粗糙程度、表面修饰、改性和材料的方向性等[5]。Baier等人认为材料表面的特性和自由能决定细胞的生物你粘附性，动物实验表明低表面能材料粘附的细胞呈球形或者椭圆形，粘附作用极弱；高表面能材料被细胞覆盖，粘附的细胞呈扁平，有伪足生长且伸长的形态，粘附作用较强。结果表明高表面能材料表面更有利于细胞粘附生长。另外，合成生物材料表面的理化结构，对细胞的粘附和生长起到重要作用。研究认为[6-7]，材料表面结构不同有不同的生物特性，比如羟基、酰胺基等，有利于细胞的生长粘附。
　　在本研究中，nPCL/HA电纺薄膜复合材料直径约为1～5μm，同时以单纯纳米级PCL非取向电纺纤维薄膜材料作为实验对照，组织工程支架材料加入纳米级羟基磷灰石晶体颗粒，通过选择适当加工参数，能够调控支架材料的孔隙率、厚度、三维结构（纵横交错或者有取向性）、降解率和动力学性能等。聚己内酯（PCL）是通过己内酯的开环聚合得到的属于人工合成的脂肪族聚酯，是一种半结晶型聚合物，其结构重复单元上有5个非极性亚甲基和一个极性酯基，使得其具有很好的柔韧性和加工性，同时具有很好的生物相容性[8-9]。该研究中三种实验材料，聚己内酯与羟基磷灰石的配比不同，分别为5:1、10:1、20:1，这样材料的表面结构和理化性质，表面能是不同的，研究通过与细胞的粘附，证明何种配比的材料能达到最佳的生长粘附、增殖分化。本实验中，细胞与材料复合培养24h后，可见不同材料表面黏附细胞数量不一，细胞形态不一。48h后，见不同材料人骨髓基质干细胞紧贴薄膜表面，细胞开始变形，大小形态不一，交错明显，细胞无伪足生长。72h后，材料之间细胞粘附的差异开始明显，有的材料细胞黏附形态大小不一，细胞伪足生长不明显；有的细胞伪足生长明显，有个别细胞未有伪足生长，个别孔隙内细胞黏附数量较多。说明细胞在材料表面生长、粘附、分化与其表面结构有密切关系。复合支架材料保持很高的孔径和孔隙率，有利于营养物质的供应，材料中的纳米HA与骨组织中的羟基磷灰石类似。我们实验中的人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）是我们研究人员志愿者捐献，通过分离传代培养获得的经检测证实细胞纯度高、性能稳定、增殖能力强。倒置显微镜观察，hBMSCs不仅可以在材料表面黏附，而且纤维愈细，孔隙率愈高，生长黏附愈好，与文献中报告相一致。本研究观察到细胞黏附与纤维的方向性（取向性）一致，即无取向电纺纤维薄膜上细胞呈杂乱生长，而取向电纺纤维薄膜上细胞呈取向性生长，也就是说取向性诱导了细胞的取向生长，并且能够短时间内变大，伸展，有伪足生长并向周围铺展。以往研究仅表明nPCL电纺纤维薄膜上细胞的相容性好，细胞能较好的黏附、生长和繁殖，而本研究结果表明，不同配比的nPCL/HA电纺纤维取向薄膜也是一种较好的骨组织工程支架材料，适合应用于hBMSCs作为种子细胞的组织构建，尤其3号电纺纤维取向薄膜材料的黏附率与单纯nPCL电纺纤维非取向薄膜的黏附率最接近。通常来说，表面粗糙的材料，细胞黏附能力优于表面光滑材料[10]。nPCL/HA大体外观光滑均匀，纤维直径1～5μm,与细胞外基质天然结构相似，同时纤维支架材料中引入的不同比率HA纳米粒子，对材料进行改性，使其表面积大，纤维均一，孔隙率高，有利于氧气和营养物质的供应、细胞的黏附、生长和分化。实验结构表明：3种材料表面的细胞黏附率有较差异性，材料的配比不同，纤维粗细不同，所取得材料物化性质和表面结构存在差异，细胞所需的氧气和营养物质穿透纤维薄膜通过率不同，从而使得细胞黏附率不同。
　　本实验表明，3号电纺取向薄膜，具有较高的孔隙率、良好的物化性质和细胞相容性，有利于种子细胞黏附生长，比另外两种材料更适合骨组织工程构建。
　　
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　　[收稿日期]2010-10-22 [修回日期]2011-01-11
　　编辑/张惠娟