【人脐带血间充质干细胞研究近况及其在脂肪组织工程中的应用】间充质干细胞的来源

　　肖宏涛 综述，刘 毅 审校 　　 　　人脐带血间充质干细胞(HUCBMSCs)是一种具有全能干细胞特点的细胞，是中胚层发育的早期细胞，其形态和生物学特点与骨髓源性间充质干细胞相似,具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等[1]。与骨髓相比，脐带血有更充足的来源，对供者无任何不良影响，其间充质干细胞更为原始，分化能力更强。因此脐带血间充质干细胞有可能替代骨髓间充质干细胞成为组织工程的重要种子细胞。脐带血间充质干细胞现已成为继骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞后又一受众多学者关注的热点，本文就脐带血间充质干细胞的研究近况及其在脂肪组织工程中的应用做一综述。
　　
　　1脐带血间充质干细胞的发现及其生物学特征
　　
　　1.1 脐带血间充质干细胞的发现：在脐带血中是否存在间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），研究初期有许多争议。Erices等[2]于2000年首次报道了从脐带血中分离培养出间充质样细胞，但在培养的29份标本中只有7份表现为间充质样细胞(Mesenehymal-like cells，MLC)，其免疫表型和功能特点与骨髓来源的MSCs极为类似，其余22份培养出的均为破骨样细胞，同时发现早产儿脐血中间充质干细胞的含量要较足月儿丰富。
　　Mareschi等[3]与上述意见不同，他们检测了35份骨髓和58份足月产脐血标本，以Percoll密度梯度离心分离单个核细胞，脐血的贴壁细胞很快衰退，表达CD45、CD14、CD31等造血及内皮细胞的标志，他们还检测了通常由MSCs分泌的两种细胞因子IL-6、IL-11和通常由单核-巨噬细胞分泌的TNFα、TGFβ的mRNA表达，结果显示脐血的贴壁细胞表达IL-6、TNFα和TGFβ，不表达IL-11，进一步证明脐血中缺乏MSCs，由此他们得出结论脐血中贴壁的单个核细胞表现出造血细胞的形态特点而不是MSCs。Yu等[4]培养了中期妊娠(16～28周)的胎儿血和足月分娩的脐带血，前者可以得到MSCs，而后者只得到异质性的贴壁细胞，表达CD45，表明属于造血细胞。Karen Bieback等[5]则通过实验证明了足月妊娠产妇脐带血中MSCs的存在，而且探究了MSCs的分离与脐血采集量、保存时间、单个核细胞数以及是否发生凝血和溶血有关。Lee等[6]应用梯度离心法从脐带血中分离到间充质干细(MSCs),并对其性质进行了初步鉴定，再次证实脐带血中存在MSCs。
　　随着研究脐带血间充质干细胞的学者越来越多，学者们的结论也逐渐趋于一致，脐带血中的确存在MSCs，但脐带血间充质干细胞所占的比例远较骨髓低得多(0.05～2.8/1.0×106脐带血单个核细胞，2～5／1.0×106骨髓单个核细胞)，脐带血MSCs连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，而且保持正常的核型和端粒酶活性。细胞周期研究表明，85％以上的MSCs处于G0/G1期，用流式细胞仪分析MSCs的RNA和DNA含量发现，脐带血MSCs有5％处于G0 期，而骨髓MSC有20％处于G0期。
　　1.2 脐带血间充质干细胞的生物学特性：近年来，对脐带血MSCs的研究已取得了重大进展，对其生物学特性也有了更深入的认识。一般认为在体外培养的脐带血MSCs的形态与骨髓MSCs相似，呈长梭形或纺锤形，只是体积稍小一些。有人还把脐带血来源的MSCs和骨髓来源的MSCs作了基因表达方面的对比，结论是：两者的基因表达除了因来源不同而导致的差别外，基本上是一致的[7]。脐带血MSCs另一个重要的生物学特性是其具有很强的增殖能力，Gang 等[8]将来源于人的新鲜脐血单个核细胞分离培养，发现传至第二代时即可见大量均一的成纤维状贴壁细胞（即MSCs），大约86％的细胞处于G0/G1期。另据有关学者[9]统计6.6×105个脐带血原代MSCs在体外扩增10代后可获得9.9×108个细胞，扩增约1 500倍。这都充分表明了这些脐带血MSCs细胞确实具有很强的增殖潜能。
　　目前已有众多学者对脐带血MSCs表面抗原特性作了研究，证实脐带血MSCs均稳定地表达与MSCs相关联的CD13、CD29 、CD44 、CD90 、CD105 (SH2)及CD73 (SH3 、SH4)抗原（SH2、SH3和SH4为MSCs相关性抗原），但不表达与造血及内皮细胞有关的CD14、CD34、CD45、CD31表面抗原[6，10-13]，这与骨髓来源的MSCs表面抗原完全一致[9，14]。脐带血MSCs所具有的多向分化潜能也是其重要的生物学特性之一。Lee等[15]用RT-PCR技术分析脐带血间充质干细胞，发现其表达多向分化基因：SDF21，NeuroD,血管内皮生长因子受体(VEGF2R1)等。同时许多试验[1，6，8]也验证了脐带血MSCs在不同的诱导条件下具有向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌细胞等分化的能力。
　　
　　2人脐带血的采集方法及脐带血MSCs的分离、培养、纯化及扩增
　　
　　2.1人脐带血的采集方法：脐带血的采集方法目前常用的是脐静脉穿刺法，选择无各种产科并发症的健康足月产妇，胎儿娩出后，在距胎儿5～7cm的脐带处进行双结扎，剪断脐带，消毒母侧脐带断端，用已消毒的注射器或负压采血袋（已用肝素抗凝，20U/ml）穿刺脐静脉抽取50ml左右脐带血液，4℃冰箱保存，不需要特殊处理，并于12h内进行分离。采集过程中必须严格无菌操作，避免按压子宫或挤压胎盘、脐带，并且注意将抗凝液充分混匀[16]。取血时间也要控制在胎儿娩出后5min之内。
　　2.2 脐带血间充质干细胞的分离：在分离脐带血MSCs方面目前尚无统一的方法，根据不同的实验条件可选用不同的方法。①密度梯度离心法：鉴于MSCs与其他细胞密度的差异，采用Pereoll或者Ficoll分离液来实现细胞间的分离。其中使用Pereol1分离液获得的MSCs大小均匀，纯度较应用Ficol1分离液获得的细胞纯度高，此方法简单有效，成本低廉；②贴壁筛选法：依据MSCs易贴附在塑料培养物上生长的特性将其与非贴壁细胞分离；③流式细胞仪分离法：根据间充质干细胞大小不同或细胞表面的一些特殊标志，采用流式细胞仪对其进行分选，该方法可获得较为纯化的间充质干细胞，但是分离过程对细胞活性影响较大，且实验条件要求较高，所需的标本量大，因此没有广泛的使用；④免疫磁珠分离法：原理是使用表面覆有特异性抗体的磁珠与间充质干细胞结合，再利用永久磁铁将间充质干细胞吸引分离出来。免疫磁珠分离法可以分离出纯度较高的细胞，但价格昂贵，难以推广；⑤单细胞克隆的方法[17]分离MSCs，实验条件要求高，所需标本量较大，不便于获得大量MSCs。此外，迟作华等[18]还采用了羟乙基淀粉沉淀法分离MSCs，此法优点是能减少体外处理步骤，减少处理过程中对细胞的损伤等，当前应用该方法的人还不多。目前最常用的方法是密度梯度离心法和贴壁筛选法联合应用[1]：先用密度梯度离心法从脐带血中分离出单个核细胞，再依据MSCs易贴附在塑料培养物上生长的特性，用贴壁筛选法将其从造血系统细胞中分离出来，从而获得纯度较高的MSCs。此法操作相对简单，可以避免仅使用密度梯度离心法分离出的细胞成分复杂的缺点，同时又可避免单用贴壁筛选法时标本中大量的红细胞占据MSCs所需贴壁空间的不足，是一种很实用的方法。
　　2.3 脐带血间充质干细胞的培养、纯化及扩增：应用间充质干细胞专用培养基（MesencultTM）或DMEM培养基（调PH至偏酸性），加10%～20%的胎牛血清（FBS），置于37℃、5%CO2孵箱内培养，在接种4～7天后出现贴壁的间充质样细胞,开始为圆形或不规则形,逐渐伸出突起,最初散在分布,与大量的破骨样细胞混杂存在。破骨样细胞胞体较大,呈圆形，内含多个核。MSCs多为成纤维样的长梭形细胞,少部分呈多角形,单个核,有较长的突起,折光性强。随着在条件培养基的环境下培养,破骨样细胞逐渐减少,两周后MSCs在局部形成包含有几十个到几百个细胞的克隆，由于细胞的迅速增殖，3周后细胞生长可达80%～90%融合，每个克隆约包含几百至几千个细胞，此时的MSCs呈较均一的长梭形。一般传代至第3代时即可获得纯度较高且形态均一的长梭形间充质干细胞。除上述常用的培养基外，还有含20%胎牛血清（FBS）+碱性成纤维生长因子(bFGF)+L-谷氨酰胺的IMDM培养基[6]及培养脐带血MSCs的无血清培养基，该培养基的最大优点是可避免含血清培养的细胞可能存在动物携带的已知或未知病原体传染人类的隐患[19]。
　　由于到目前为止还没有十分完善的培养扩增脐带血MSCs的方案，于是许多学者便纷纷着手于培养条件优化方面的研究。Shetty等[20]将含人脐带血血清的DMEM/F12培养基与含胎牛血清的DMEM/F12培养基进行了对比，证实不同来源的MSCs在含人脐带血血清的DMEM/F12培养基中培养有更大的增殖能力，在培养MSCs方面更高效。刘素芳[21]采用四种不同的培养基作了对照，分别是低糖DMEM (Dulbecco改良的Eagle培养基)组、高糖DMEM组、低糖DMEM+干细胞因子组、MesencultTM培养基（一种特殊成分的液体培养基，与其添加物配合使用可促进间充质干细胞分化为脂肪细胞）组，结果发现低糖DMEM +干细胞因子组和MesencultTM培养基组细胞生长旺盛，提示这两种方法较好。但是由于干细胞因子用量较大，价格较贵，所以低糖DMEM +干细胞因子联合应用干细胞因子的方法并不十分适用。MesencultTM培养基为酸性培养基，能促进脐带血MSCs增殖，保持其未分化状态，其酸性环境也有助于消除造血干细胞和破骨样细胞[22]，因此，MesencultTM培养基是一种适合脐带血间充质细胞生长的培养基。
　　总之，不同的培养基、不同批次的血清、不同的PH值、不同的种植密度都可能影响MSCs的生长。与骨髓MSC相比，目前脐血来源的MSCs仍存在数量少、频度低等问题。据统计[9]约1/4的脐血样单个核细胞培养后出现MSCs，3/4的脐血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞，因此，在体外培养过程中，如何消除破骨样细胞的存在，如何更好地对其进行纯化扩增，以获得稳定、均一的MSCs仍是今后需努力探索的方向。
　　
　　3脐带血间充质干细胞的识别
　　
　　由于尚无特异性标记物，目前脐带血MSCs的识别方法都是通过形态学及在培养过程中出现的分子表型，如：表达CD13、CD29、CD44、CD90、CD105、CD73，而不表达与造血及内皮细胞有关的表面抗原CD14、CD34、CD45、CD31，然后逆推得知是否为MSCs，还有体外培养时，给予不同的诱导条件，分离细胞出现分化表型，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等，从而逆推其为MSCs[1]。还没有直接的方法可鉴定得到的脐带血MSCs。
　　
　　4脐带血MSCs成脂分化及调控脂肪细胞分化的信号转导途径（通路）
　　
　　4.1 脐带血MSCs成脂分化：脂肪细胞系是由起源于中胚层的多能干细胞逐步分化、发育而成,其过程大致为：多能干细胞（Multipotential stem cell）-脂肪母细胞(Adipoblast)-前脂肪细胞(Preadipocyte)-不成熟脂肪细胞(Immature adipose cel1)-成熟脂肪细胞(Adipocyte)[23]。脐带血MSCs向脂肪细胞分化同样要经历这一过程。目前在体外诱导脐带血MSCs成脂分化的方案基本统一：先将体外扩增培养的脐带血MSCs置于孔板或培养皿中，当细胞贴壁生长达到80%融合时，加入脂肪诱导剂（地塞米松1μmol/L、10mg/mL胰岛素、0.5 mmol/L1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、100μmol/L吲哚美辛）后，置于37℃、5%CO2孵箱内培养。一般诱导7天后，胞质内开始出现小脂滴，14天后胞质内形成高折光性脂滴脂肪细胞，诱导培养21天，脂滴逐渐增大可充满整个细胞，油红O染色示胞核成蓝色，脂滴呈桔红色，脂肪细胞平均占（88.0±4.6）%[9]。脐带血MSCs在向脂肪细胞诱导分化的这一过程中，首先是MSCs在体外实验性诱导剂（如上述诱导剂）、生物活性因子、寒冷、激素等因素刺激下逐渐分化为单能干细胞,即脂肪母细胞，它保持着干细胞增殖活跃的特性，然后再进一步分化为前脂肪细胞，前脂肪细胞在经历细胞融合、接触抑制和克隆扩增等步骤后继续启动向成熟脂肪细胞分化的过程，并在胰岛素、地塞米松、l-甲基-3-异丁基黄嘌呤等诱导剂协同作用下最终分化为成熟的脂肪细胞。
　　4.2调控脂肪细胞分化的信号转导途径（通路）：多细胞生物的大多数细胞不与外界直接接触，对外界的刺激需要细胞间复杂的信号传递系统来传递，细胞信号传导途径（通路）是信号传递系统重要组成部分。信号传递系统通过信号转导途径（通路）对细胞进行着多方面的调控，其中包括对细胞分化的调控：使基因有选择地表达，使细胞不可逆地分化为特定功能的成熟细胞。
　　脂肪细胞的分化主要是通过四条信号转导途径（通路）来调控： ①胰岛素样生长因-1 (IGF-1)激活的酪氨酸激酶途径；②糖皮质激素/前列环素(PGI2)途径；③cAMP-蛋白激酶A(PKA)途径；④脂肪酸激活受体(FAAR)途径。由于各种细胞系所处的发育阶段不同, 故转导途径的激活方式也有所不同[24]。研究表明, 前脂肪细胞有众多的IGF受体(IGF-1R)，但胰岛素受体很少。生长激素和高浓度的胰岛素通过IGF-1R诱导前脂肪细胞分化，此作用能被生理浓度的IGF-1所代替,IGF-1诱导脂肪细胞分化的信号转导途径可能主要通过:IGF-1R→胰岛素受体底物1(IRS-1)磷酸化→SHc接头蛋白→生长因子结合蛋白(Grb2)→鸟苷二磷酸释放因子(SOS)→Ras 蛋白→Raf-1蛋白激酶→脂肪细胞特异基因的转录[25]。除上述的信号转导途径（通路）外，促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路也是调控脂肪细胞分化的一条重要信号传导通路,它对脂肪细胞分化的调控复杂多样，且贯穿整个分化过程[26]。
　　
　　5脐带血MSCs在脂肪组织工程中的应用前景
　　
　　组织工程是工程学和生物科学相结合的新兴学科,主要研究组织和器官的组织相容性替代物来维持和改善组织及器官的形态和功能,它在整形外科有广泛的应用前景。其基本原理是将体外扩增具有特定生物学功能的种子细胞与可降解生物材料结合形成细胞-材料复合物,体外培养一定时间后植入体内,种子细胞在体内或体外不断增殖并分泌细胞外基质,生物材料被逐渐降解吸收,最终形成所需要的具有一定形态和功能的组织或器官,以修复病损和重建功能。其主要由种子细胞、生物材料、组织构建及临床应用四个研究方面构成。
　　组织工程的种子细胞来源有多种，包括胚胎干细胞、自体细胞、成体干细胞等。寻求具有容易获得、容易体外培养增殖、长期传代不改变生物学特征、抗原性小、组织修复能力强等特性的理想的种子细胞是组织工程研究的核心问题之一，脐带血MSCs具备上述条件，原因为：成体干细胞中的脐带血MSCs不涉及自体细胞疾病状态下或老年患者的细胞往往增殖能力下降及胚胎干细胞的伦理学问题，同时还有强大的自我更新能力及多向分化潜能。且脐带血MSCs与骨髓MSCs相比还有以下优势：干/祖细胞较骨髓中更原始，增殖分化能力更强；淋巴细胞的免疫功能不够成熟，移植物抗宿主病(GVHD)发生率较低；不会有肿瘤细胞等[14]。此外，和骨髓相比，脐带血还有来源丰富，采集简便等优点。因此，脐带血MSCs现已成为备受中外学者重视的种子细胞。
　　自体脂肪移植已有上百年的历史，因其来源丰富，取材容易，操作简单，填充后外形好，无排斥反应等优点，备受整形美容外科的重视，但由于移植后脂肪细胞的成活率较低而达不到理想的疗效，脂肪组织工程的应用有望摆脱这一困境。脐带血MSCs通过成脂诱导可分化为前脂肪细胞，且目前已有前脂肪细胞接种在PLGA支架、蚕丝支架[27]、HYAFF11（透明质酸衍生酯）海绵支架[28]、胶原海绵、降解性毛毡、水凝胶、氟羟甲睾酮单丝膨化的聚四氟乙烯复合材料的报道,这些支架为前脂肪细胞在立体环境中培养保证其正常的形态和功能提供了条件。前脂肪细胞可与具有良好生物相容性和可降解性的三维支架体外复合培养，在恰当的时机将这种组织化细胞-支架复合物移植到软组织缺损部位，随着支架的降解和前脂肪细胞的不断分化，这种组织化细胞-支架复合物将成为新的具有功能的活体脂肪组织。这种策略形成的脂肪可作为软组织缺损部位的填充材料，有望对小乳症、颜面萎缩、凹陷畸形等整形美容外科常见疾病提供满意的治疗。
　　脐带血MSCs为组织工程研究提供了良好的种子细胞,通过深入研究它的分化机制、建立体外三维立体培养条件及开发体内应用的新型生物材料，相信在不久的将来一定能构建出适合于临床的组织工程脂肪。随着研究不断深入,脐带血MSCs在脂肪组织工程中的应用必将产生巨大的经济及社会效益。
　　
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　　[收稿日期]2007-08-29[修回日期]2007-11-07
　　编辑/李阳利