切应力对人骨髓间充质干细胞增殖的影响:捐骨髓和捐干细胞

　　[摘要]目的：探讨切应力作用于人骨髓间充质干细胞(HMSCs)后，对细胞增殖的影响。方法：将HMSCs种植于平板流动腔中，待贴壁后对其施加1dyne/cm2的切应力作用6h，用MTT法测细胞增殖曲线，并用流式细胞仪测定细胞周期，计算增殖指数。结果：发现HMSCs在1dyne/cm2切应力作用6h后，增殖曲线抬高，G2+S期细胞明显增加。结论：HMSCs在切应力作用下，增殖能力增强，是组织工程血管种子细胞的理想选择。
　　[关键词]切应力；骨髓间充质干细胞；增殖；细胞周期
　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0325-03
　　
　　Shear stress stimulates mesenchymal stem cells proliferation
　　SUN Yang1, YI Wei2, WEI Xu-feng2, YI Ding-hua2, GUO Shu-zhong1
　　（1.Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital； 2. Department of Cardiovascular Surgery. The Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi,China）
　　Abstract：Objective To discover the effect of fluid shear stress on the proliferation of human mesenchymal stem cells (HMSCs). Methods HMSCs were cultured on the bottom of the flow chamber for 1 day before exposure to fluid shear stress，and then exposed to 1 dyne/ cm2 shear stress for 6 h. We can acquire the proliferation curve by means of MTT and gain the cell cycle and cell proliferative index. Results Discovered that under the action of 1 dyne/cm2 shear stress for 6 h, HMSCs improved their capability of proliferation. Conclusion HMSCs gain better ability of proliferation after exposure to shear stress, and they are promising seed cells in the field of tissue engineering blood vessels.
　　Key words：shear stress; human mesenchymal stem cells;proliferation; cell cycle
　　
　　临床工作中常会遇到患者血管损伤，而自体血管取材受限的问题，异体血管存在免疫排斥反应，人工血管又容易导致血管栓塞，因此，人们对组织工程血管给予了更多关注。内皮细胞作为组织工程血管种子细胞，取材受限，且无法发挥理想的生物学功能。骨髓间充质干细胞（MSCs）具备增殖能力强，具有多向分化潜能，可逃避机体免疫监视，取材方便，易于体外培养扩增等优点，受到组织工程血管研究的关注。MSCs作为组织工程血管的种子细胞，当其植入体内后必然要面临血液流体切应力的考验，已有研究表明流体切应力可促进血管平滑肌细胞、内皮细胞及成骨细胞等的增殖[1-3]，高切应力作用亦可促进MSCs的增殖[4]，但低切应力作用较短时间（30min）可促进MSCs向成骨细胞分化，却不能明显促进MSCs的增殖[5]。那么，低切应力作用于MSCs较长时间后，对其增殖会产生怎样的影响，目前尚未见报道。本实验对人骨髓间充质干细胞（HMSCs）施加1dyne/cm2切应力作用6h后，观察细胞增殖的情况，了解低切应力作用于HMSCs较长时间后对其增殖的影响，探讨在低切应力作用下培养HMSCs是否更利于促进其增殖。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 HMSCs的分离与培养：取人髂骨骨髓（来自志愿者），PBS稀释后溶液以300g/min的速度离心5min。弃上清液，再用培养基重悬沉淀，加入到梯度Percoll（Sigma）液中，以900g/min的速度离心20min。吸取交界面白膜层，用PBS重悬细胞后，以300g/min的速度离心5min，再用含10％FBS（Gibco）的DMEM（Gibco）培养基重新悬浮细胞，300g/min离心5min后，弃上清液。加少量含10％FBS的DMEM培养基，吹匀后置于培养瓶内培养。24～48h后更换培养液，弃去未贴壁细胞。5～6天消化分瓶传代培养。
　　1.2 HMSCs表面抗原的鉴定：用2.5g/L 胰蛋白酶消化后收获第3代细胞，其分别与抗CD29，CD34，CD45（均购自SantaCruz公司）的单克隆抗体饱和溶液在室温下反应30 min，然后用PBS洗涤2次，再与FITC标记的二抗避光作用15min。最后用PBS洗涤并重悬于PBS中，对HMSCs表面抗原进行流式分析。
　　1.3 HMSCs诱导分化为脂肪细胞能力鉴定：诱导脂肪细胞的培养基由1mM右苯丙胺(Sigma)、0.5mM 3-异丁甲基黄嘌呤(Sigma)、0.1mM吲哚美辛(Sigma)及10mM胰岛素组成，HMSCs在该培养基中培养14天后，用10%的甲醛（Sigma）固定1h。然后用60%异丙醇洗涤，再用油红O染色10min。
　　1.4 HMSCs诱导分化为成骨细胞能力鉴定：诱导成骨细胞的培养基由胎牛血清（Gibco）、10-7M地塞米松（Sigma）、0.15mM维生素C (Sigma)及2mMβ-磷酸甘油(Sigma)组成，HMSCs在该培养基中培养20天后，用多聚甲醛（Sigma）固定。然后在固定后爬片上作骨钙素(B＆D)免疫组化染色，以鉴定所培养的HMSCs是否具备分化为成骨细胞的能力。
　　1.5 剪切力作用：将经过鉴定的HMSCs种植于平板流动腔内（宽2.5cm,高0.05cm，长10cm），置入37℃培养箱24h后，将平板流动腔两端接动力装置管道（体外循环D型管道），动力装置（Cobe体外循环机,购自美国）置于培养箱外。调节速度至500ml/min, 6h后取出平板流动腔，收集细胞样本。
　　1.6 剪切力的计算：根据公式τ＝Qη/Sh，τ为剪切力大小，Q为流量500ml/min，η为含10％FBS的DMEM培养基粘滞系数0.013Pa・s（37℃），S为平板流动腔的横截面积0.125cm2, h为高度0.05cm，计算得τ为1dyne/cm2。
　　1.7 MTT法测定细胞增殖曲线：1dyne/cm2切应力作用于平板流动腔中的HMSCs6h后，分别用胰酶消化切应力作用前(对照组)和作用后（实验组）的细胞，计数后种植于96孔板中，待24h细胞重新贴壁后，实验组和对照组各选5孔, 每孔加入20μlMTT,4h后吸除培养基及MTT，再加入二甲基亚砜150μl，用酶联免疫检测仪测定两组细胞在490nm波长处光吸收值。连续测定7天。
　　1.8 流式细胞术测定细胞周期：切应力作用6h后，分别用胰酶消化实验组和对照组细胞，按细胞周期分析试剂盒（BD 公司)说明书对细胞DNA 进行染色，流式细胞(FACSCalibur，BD公司)测定细胞周期分布，所用拟合软件为ModFitLT(肋公司)。每组实验重复3次。
　　1.9 统计：用SPSS软件分析。
　　
　　2结果
　　2.1 流式细胞仪对HMSCs表面抗原鉴定结果：HMSCs表面抗原CD29阳性，而CD34和CD45阴性，表明培养细胞为HMSCs，并且在体外扩增过程中能够保持其特征。可排除造血干细胞的污染（图1）。
　　2.2 HMSCs向脂肪细胞诱导分化的结果：可见诱导分化后的细胞胞浆内出现红色脂肪小滴，说明所培养的HMSCs具备向脂肪细胞分化的能力，在体外扩增培养过程中保持了干细胞的特征（图2）。
　　2.3 HMSCs向成骨细胞诱导分化的结果：诱导分化后的细胞胞浆内出现棕褐色小颗粒沉淀，显示诱导分化后的细胞骨钙素免疫组化染色阳性，已诱导为成骨细胞。亦可证明体外分离培养的细胞为HMSCs（图3）。
　　2.4 光镜下观察结果：1dyne/cm2的切应力作用于HMSCs6h后，与切应力作用前比较，HMSCs数量未见明显减少，细胞形态基本未发生改变，细胞排列极性有所改变（图4）。
　　2.5 MTT法测定细胞增殖曲线结果：1dyne/cm2切应力作用后2～7天，HMSCs增殖能力明显比对照组细胞增强（图5），其中第4天、第6天、第7天的MTT值均具有显著差异，P值分别为0.012，0.006，0.002。
　　2.6 细胞周期测定结果：切应力作用组，处于G2+S期的HMSCs为41.2%，未受切应力作用组，处于G2+S期的HMSCs为11.9%，差异显著。表明切应力作用可明显促进HMSCs的增殖（图6）。
　　
　　3讨论
　　长期以来，切应力对组织工程血管种子细胞作用及机制的研究都是人们关注的热点，从过去在流体切应力对内皮细胞作用的研究中，我们可以发现学者的观点并不统一，有研究发现，切应力可促进内皮细胞的增殖[2]，而又有研究表明高切应力可抑制内皮细胞增殖，低切应力对内皮细胞增殖无影响[6]。由于内皮细胞自体取材受限，且体外分离培养后生物学功能不理想，MSCs具备多向分化潜能，可体外诱导分化为内皮细胞和平滑肌细胞[7]，且易于取材及体外扩增培养，是组织工程血管研究较理想的种子细胞。已有研究表明，高切应力作用可促进MSCs的增殖[4]，低切应力作用较短时间仅能使MSCs的增殖增加1.2倍[5]。然而，低切应力作用于MSCs较长时间，对其增殖产生的影响，尚未见报道。本实验对HMSCs施加1dyne/cm2切应力作用6h，发现细胞数量未见明显减少，说明细胞在切应力作用下粘附功能较好，MTT法及细胞周期检测的结果均表明细胞在1dyne/cm2切应力作用下增殖能力明显增强。以上结果说明在低切应力作用下，HMSCs作为组织工程血管种子细胞，可以保持良好的增殖能力，为下一步的体内实验奠定了基础。同时，提示在低切应力作用下培养HMSCs，更容易促进细胞增殖，可考虑优化体外培养HMSCs的条件。
　　 综上所述， HMSCs在1dyne/cm2切应力作用下，细胞的增殖能力明显增强。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2008-11-05[修回日期]2009-1-6
　　编辑/张惠娟