喘息胜疾病与气道平滑肌干细胞 人脂肪干细胞向血管平滑肌细胞诱导分化的实验研究

　　[摘要]目的:体外诱导培养人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs),观察是否可以分化形成血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs),为构建组织工程化血管寻找新的种子细胞来源。方法:免疫磁珠法分选收集原代脂肪干细胞,加入PDGF-BB、TGF-β1诱导14天后进行检测。结果:实验组细胞生长呈现血管平滑肌细胞所特有的峰谷样生长,血管平滑肌细胞特有的表面抗原标记物表达阳性。结论:脂肪干细胞定向诱导培养后,具有血管平滑肌细胞的特性,有可能成为构建组织工程化血管新的种子细胞来源。
　　[关键词]脂肪干细胞;血管平滑肌细胞;血小板衍生生长因子;转化生长因子β1
　　[中图分类号]Q813.1 R622.4 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)02-0215-03
　　
　　Experiments of adscs induced into vascular smooth muscle cells
　　JIANG Wei1,CAO Qiang1,WANG Ji-hua2,FENG Xing-hua1
　　(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China; 2. Department of Plastic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650101,Yunnan,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of ADSCs differentiating into VSMCs in vitro and to find the new source of seeding cells in constructing the tissue-engineered vessels.MethodsTo separate the cells from the original adipose stem cells by MACS and culture 14 days with PDGF-BB and TGF-β1.ResultsThe cells show "peak and valley" growth pattern specified as mature VSMCs and express the VSMC"s markers.ConclusionADSCs were induced in vitro in specific environment,the cells show the significant characteristics of VSMCs and have the potentiality being seeding cells of construct the tissue-engineered vessels.
　　Key words: adipose-derived stem cells; vascular smooth muscle cells; platelet derived growth factor BB; transforming growth factor beta
　　
　　脂肪干细胞由中胚层分化发育而来,具有类似于骨髓间充质干细胞的干细胞特性[1],可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞和成骨细胞分化[2],而且脂肪干细胞取材更方便、更容易获取。研究发现:体外培养ADSCs可表达肌源性标志物MyoD1 和肌球蛋白重链[3],体内实验也证明其表达α- 肌动蛋白[4]。本实验观察研究了脂肪干细胞在特定的诱导环境下,向血管平滑肌细胞分化的情况。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 主要试剂与仪器:FBS、M-199 培养基(Gibco公司,美国);TGF-β1(transforming growth factor, TGF-β1)、PDGF-BB(platelet derives growth factor-BB, PDGF-BB)(Sigma公司,美国);单克隆鼠抗人α平滑肌肌动蛋白(α-SMA,Dako Cytomation公司,美国);单克隆鼠抗人平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC,Chemicon公司,加拿大);单克隆鼠抗人Calponin、单克隆羊抗人SM22α(Abcam公司,美国);倒置相差显微镜(Olympus公司,日本);LSN-510 激光共聚焦显微镜(Zeiss公司,德国)。
　　1.2 ADSCs 分离培养与传代:脂肪组织由脂肪抽吸术获得,37℃摇床中0.075%Ⅰ型胶原酶消化PBS清洗的脂肪,60min,加入同体积含10% FBS的M-199 培养液终止消化。300×g离心10min,去上清,100目滤网过滤,加入10%M199培养液吹打均匀接种,恒温培养24h后PBS去除未贴壁的细胞。
　　1.3 免疫磁珠(MACS)细胞分选:胰酶消化法收集生长至融合的原代细胞,离心去除上清,加入5%BSA/PBS吹打均匀,200目滤网过滤后离心去除上清,加入CD34b和CD34fc,比例为100μl/108cells,4°C避光30min,加入5%BSA洗除未结合抗体,离心去除上清,加入5%BSA进行免疫磁珠分选,得到CD34+的细胞。
　　1.4 实验分组:分选出的CD34+细胞生长至融合后,酶消化法收集细胞,以2×104个/cm2接种于培养皿,实验组用加入含2.5ngTGFβ1、50 ng/ml PDGF-BB的5% M199培养液培养,对照组以5%M199培养液培养。
　　1.5 检测指标
　　1.5.1 常规培养并隔日换培养液每日观察细胞生长情况和形态特征变化。
　　1.5.2 免疫荧光检测:培养14天后,收集两组细胞,用乙醇及冰醋酸以99:1 比例固定15min,PBS漂洗,10%羊血清封闭30min,加入以0.1% BSA稀释的1:100 抗体:α-SMA、SM-MHC和Calponin,4℃过夜,PBS漂洗,滴加FITC标记相应二抗,37℃孵育30min,PBS漂洗,碘化丙啶衬核后,荧光显微镜下观察。胞浆内绿色荧光为阳性表达,细胞核为红色荧光。
　　
　　2结果
　　
　　2.1形态学:原代培养的脂肪干细胞贴壁后呈纺锤形或梭形,类成纤维细胞生长(图1A);MACS分选获得的脂肪干细胞生长呈纺锤形(图1B),诱导48h后,形态较对照组有所增大并有一定方向性(图1C),7天后呈现血管平滑肌细胞所特有的“峰-谷”样生长(图1D);对照组细胞形态呈梭形或纺锤形,类成纤维样生长,约5～6天可生长至融合。
　　2.2 免疫荧光检测(图2):分别取诱导生长14天的实验组和对照组细胞,制作爬片后进行免疫荧光检测,结果显示实验组表达血管平滑肌细胞特有的表面抗原标记物α-SMA、Calponin、SM22α和SM-MHC,对照组无阳性表达,IgG为不加一抗,只加FITC二抗的自发光图片。绿色为阳性表达,红色为衬染的细胞核。
　　
　　3讨论
　　
　　组织工程是目前对组织缺损修复的研究热点,但其种子细胞的来源一直是所要解决的关键技术问题。脂肪干细胞来源广泛、取材培养简单方便,并具有多向分化潜能,是组织工程目前研究的热点之一。原代及传代后的ADSCs均有较高的干细胞相关抗原表达,经过传代后,造血系和内皮系细胞的污染迅速降低,细胞成分得以相对纯化,此实验我们又通过MACS分选的方法分离出CD34+的细胞,使获得的ADSCs得到进一步的纯化。
　　在胚胎血管发生过程中,首先通过血管发生或血管生成的方式,内皮细胞延伸形成内皮细胞索,继而形成血管内皮细胞管,构成脉管系统的基本框架。随后,内皮细胞释放募集因子,募集周围间充质细胞向内皮细胞靠拢、贴附,包绕在管腔表面,形成最初的周细胞,然后在其它生长因子以及细胞间接触作用下,周细胞分化形成血管平滑肌细胞并增殖为多层细胞,管壁不断增厚,管腔逐渐延伸。在其过程中内皮细胞通过分泌PDGF-BB招募壁细胞前体细胞,PDGF-BB是间充质细胞强烈的有丝分裂原,促进其增殖[5-7];而TGF-β1是影响VSMCs 分化的最重要因子,此过程中分泌的TGF-β1加速了未分化的间充质细胞的增殖并向VSMCs的转化,具有抑制细胞增殖作用,并促进周细胞向VSMCs 分化的作用[7],因此我们选择了在诱导液中加入这两种生长因子。
　　血管平滑肌特异的细胞内标记物为α-SMA、Calponin、SM-MHC 和SM-22α[9]。Hirschi [10]认为,任何细胞的标记物都不是单一的存在于某种细胞,在其它种类细胞中都可能存在,某个单一的标记物表达不足以证实细胞向平滑肌细胞分化,如果同时检测多种标记物的表达,该细胞可基本认定为平滑肌细胞。
　　我们对实验组细胞进行了细胞形态、免疫荧光的检测,诱导后的脂肪干细胞表现出平滑肌细胞所特有的峰谷生长模式;表达平滑肌细胞的标记物α-SMA、Calponin、SM22α和SM-MHC,可以初步认定脂肪干细胞在模拟体内血管平滑肌细胞生长的环境下,向血管平滑肌细胞表型转化,为寻找新的组织工程种子细胞提供了新的思路。当然我们还需继续检测ADSCs分化的得到细胞是否具有血管平滑肌细胞的功能,为构建组织工程化血管提供新方法。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell,2002,13: 4279-4295.
　　[2]Daniele Peroni,Ilaria Scambi,Annalisa,et al. Stem molecular signature of adipose-derived stromal cells[J]. Experimental cell research,2008,314:603-615.
　　[3]Mizuno H,Zuk PA,Zhu M,et al .Myogentic differentiation by human processed lipoaspirate cells[J]. Plast Reconstr Surg,2002,109(1):199 -209. [4]Jack GS, Almeida FG, Zhang R, et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction[J]. Urol, 2005, 174 (5): 2041- 2045.
　　[5]Hirschi KK,Rohovsky SA,D"Amore PA. PDGF,TGF-β,and heterotypic cell-cell interactions mediate endothelial cell-induced recruitment of 10T1/2 cells, and their differentiation to a smooth muscle fate[J]. Cell Biol,1998,141: 805-814.
　　[6]Lindahl P,Johansson BR,Leveen P,et al. Pericyte Loss and Microaneurysm Formation in PDGF-B_Deficient Mice[J]. Science,1997,277: 242-245.
　　[7]Hirschi KK,Rohovsky SA,Beck LH,et al. Endothelial Cells Modulate the Proliferation of Mural Cell Precursors via Platelet-Derived Growth Factor-BB and Heterotypic Cell Contact[J]. Circ Res,1999,84: 298-305.
　　[8]Grainger DJ,Metcalfe JC,Grace AA,et al. Transforming growth factorbeta dynamically regulates vascular smooth muscle diff erentiation in vivo[J]. Cell Sci,1998,111(Pt 19): 2977-2988.
　　[9]Kashiwakura Y,Katoh Y,Tamayose K,et al. Isolation of bone marrow stromal cell-derived smooth muscle cells by a human SM22 alpha promoter: in vitro diff erentiation of putative smooth muscle progenitor cells of bone marrow[J]. Circulation,2003,107(16): 2078 -2081.
　　[10]Hirschi KK, Rohovsky SA, D"Amore PA. PDGF,TGF-beta, and heterotypic cell-cell interactions mediate endothelial cell-induced recruitment of 10T1/2 cells and their differentiation to a smooth muscle fate[J]. Cell Biol,1998,141(3):805-814.
　　
　　[收稿日期]2009-10-23 [修回日期]2010-01-12
　　编辑/张惠娟