生长因子缓释微球的制备及其对内皮细胞的影响:内皮细胞生长因子

　　[摘要]目的：制备碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子（VEGF） 可降解缓释微球,考察其生物活性的保存情况及它们对内皮细胞的作用。方法：采用改良的乳化冷凝法交联制备复合bFGF、VEGF 的明胶缓释微球,将它们加入内皮细胞的培养液中,用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MTT法)测定细胞增殖情况。结果：复合bFGF、VEGF的缓释微球平均粒径（11.32±3.64）μm;培养1天后各组细胞计数、吸光度(A)值差异均无显著性;5天后两种生长因子缓释微球组细胞计数、吸光度(A)值明显高于对照组;7天后两种生长因子缓释微球组值仍高于其它组。结论：复合bFGF、VEGF的缓释微球制备工艺简便,具有良好的缓释活性能较长时间地持续释放活性bFGF、VEGF,可明显促进内皮细胞的增殖。
　　[关键词]成纤维细胞生长因子;血管内皮生长因子；微球；明胶；缓释系统；内皮细胞
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）11-1538-05
　　
　　The preparation of growth factors-impregnated microsphere and its effect on endothelial cells
　　WANG Lu,GUO Shu-zhong,SUI Ji-qiang,MA Xian-jie,SONG Bao-qiang,YI Cheng-gang
　　(Institute of Plastic Surgery of People"s Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo prepare the bFGF、 VEGF- impregnated microsphere and to investigate its bioactivity and its effect on endothelials.MethodsThe bFGF、 VEGF - impregnated microsphere was prepared by emulsified cold -condensation method and was added to the RPMI 1640 medium. The proliferation of cultured endothelials were measured by cell counting and MTT method.ResultsThe average diameter of microsphere was(11.32±3.64)μm; the in vitro cellular study showed no significant difference in the cell number and cell viability of 4 groups 1 day after plate culture. The cell number and cell viability in bFGF、VEGF - impregnated microsphere group were more than those in other groups 5 days after plate culture. 7days after plate culture,the cell number and cell viability in bFGF、 VEGF - impregnated microsphere group were still higher.ConclusionThe preparing method is simple and accurate , the bFGF、 VEGF- impregnated microsphere can promote the proliferation of endothelials through a long period ofbFGF、 VEGF sustained - release.
　　Key words:fibroblast growth factors;vascular endothelial growth factors;microspheres;gelatin;sustained-release system; endothelial cells
　　
　　组织移植是整形外科常用的治疗手段之一, 用于各种组织缺损的修复，也可以作为组织填充的材料，改善患者的外貌和体形。移植组织需要在受区重新建立血运，而在重新建立血运之前处于缺血状态，但组织的耐缺血时间是有限的，如果不能及时建立血液循环，将会导致移植组织缺血坏死。利用生长因子局部应用促进血运重建取得了一定的效果，但外源性生长因子半衰期短，一次给药效果不甚理想。
　　采用微球系统控制生长因子局部释放是解决上述问题的一种有效方法。近年来，利用缓释系统延长生长因子局部作用时间促进血管新生，从而促进移植组织的血运重建是整形外科最活跃的研究领域之一。本实验制备VEGF及bFGF的明胶缓释微球并作用于内皮细胞,通过细胞计数法、细胞活力检测法,检测缓释微球的缓释活性及其对内皮细胞的增殖作用。 为临床提供一种促进移植组织血运重建的新方法，并为组织工程的发展奠定一定的基础。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 试剂与设备：bFGF、VEGF(珠海亿胜生物制药有限公司)、RPMA1640 复合培养液(美围Gileco公司)、明胶(等电点50,相对分子量99 000, Sigma)、胰蛋白酶(美国Sigma公司)、噻唑蓝(美国Sigma公司)、 美国Bio-RAD Model 550酶标分析仪、日本H600-1V型透射电镜、美国FJ一2003型计数仪。自制bFGF-明胶微球、VEGF-明胶微球。人bFGF /VEGF定量ELLISA试剂盒(QuantiKineR, R&Dsystems), 250g/L戊二醛,丙酮,异丙醇,无水乙醚,液体石蜡,氨基乙酸为国产分析纯,Span-80(Sigma公司)为进口分析纯,水为双蒸水,JJ21型精确电子搅拌器仪, TGL216G高速离心机,GENESIS冻干机(Virtis公司),BX241数码显微镜(Olympus)。ECV304内皮细胞系购自第四军医大学细胞工程中心。
　　1.2方法
　　1.2.1 bFGF-明胶微球的制备：将含有10g/L Span-80的液体石蜡30ml置于三口瓶中预热至55℃,快速搅拌下滴加入同样温度的明胶水溶液4ml,并调节搅拌速度至450r/min,继续搅拌10 min；形成油包水乳剂后迅速改冰浴,搅拌10min,使其完成固化；加入250g/L戊二醛0.1ml,搅拌下预固化2h,而后4℃固化24h,用丙酮、异丙醇、乙醚洗涤,挥去乙醚,真空干燥,得到粉末状淡黄色微球。用双蒸水洗净有机溶剂并冻干。将200μl的bFGF溶液滴加在20mg的冻干明胶微球上,在4℃保持24h以使bFGF完全融入微球。钴-60照射灭菌封存。将生理盐水浸泡过的明胶微球涂片置于光镜下,观察其外形及分散度,同时测量膨胀系数。电镜下测量500个微球的直径计算其平均粒径。以算术平均径为微球的平均粒径,计算公式为：平均粒径= n1 d1+n2 d2+……+nn dn/n1+n2+n3+……+nn,式中n1，n2……nn为粒子数，d1，d2……dn为粒径。
　　1.2.2 VEGF- 明胶微球的制备（同1.2.1）
　　1.2.3 bFGF/VEGF 缓释微球的体外释药实验：根据人bFGF/VEGF ELISA试剂盒说明用酶联免疫仪于490nm测定吸光度值(A值)绘制标准曲线.取微球样品10mg,放入PBS(pH7.4)缓冲液中,完全溶解后定容至100ml，取10μl另加90μl共100μl测出A值。由此计算出微球的载药率和包封率。载药率=(投药量-上清液中药量)/微球重量×100%；包封率=(投药量-上清液中药量)/投药量×100%。
　　动态透析法进行体外释药实验,将制备的复合缓释微球10mg混悬于PBS(pH7.4)100ml中,置于37℃水浴摇床(135r/min)分别于各时间点(1,2,3,4,5,6,7天)取上清液100μl,测量其浓度,绘制复合微球释药曲线。
　　1.4 内皮细胞的培养和实验分组：将购买的内皮细胞ECV304细胞系培养至铺满瓶底后,用0.25％胰酶消化5min，用含10％胎牛血清的RPMI 1 640终止胰蛋白酶作用。吸管吹散细胞团块以获取单个内皮细胞。将悬浮细胞接种于25ml培养瓶，细胞密度为5×105/瓶，置37℃，5％CO2孵箱培养。待细胞融合成单层后再传5代培养备用。实验分为四组：A组培养液为含体积分数10％小牛血清+20ng／ml VEGF、bFGF缓释微球剂的RPMI 1 640，B组培养液为含体积分数10％小牛血清+20ng／ml VEGF缓释微球剂的RPMI1640，C组培养液为体积分数10%胎牛血清+20ng／ml bFGF缓释微球剂的RPMI 1 640，D组培养液为体积分数10%胎牛血清+与A组等量的空白微球的RPMI 1 640(空白对照组)。
　　1.5 VEGF、bFGF缓释微球对内皮细胞数量的影响：取第5代培养的内皮细胞，以1×107／L接种于24孔板，使细胞长同步后按实验分组换成不同的培养液分别于培养1、3、5、7天收集细胞，每个时相点设3个重复测量孔，用血球计数板计数。实验重复5 次。
　　1.6 VEGF、bFGF缓释微球对内皮细胞活力的影响[四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)：取第5代培养的内皮细胞，以1×107／L密度接种到96孔板，每孔200μl，使细胞生长同步后按实验分组换成不同的培养液。分别于培养1、3、5、7天按常规先后加入四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)，每个时相点设4个重复测量孔，用酶标分析仪依次检测每孔吸光度（A)值，检测波长为490nm。实验重复5 次。
　　1.7 统汁学分析：结果以x±s表示：采用SPASS 10.0软件进行统计分析和处理，四组均数间的比较采用t检验，多组均数间的比较采用单向方差分析(One-wayANOVA)。以P0.05)；3天时,各组内皮细胞数较,A组>B组>C组>D组,各组间差异均有显著性差异(q检验,P0.05)；3天 时,各组A值比较, A组>B组>C组>D组,B组与C组间差异有显著性(q检验,PB组>C组>D组,缓释微球组A 值明显高于对照组(q检验,P 　　由于生长因子稳定性差,生物膜透过性差, 局部作用半衰期短,如bFGF在体内的半衰期仅为3～10min，直接应用效果不佳,而缓释微球载体作为新型药物缓释控释系统之一,具有缓释药物、靶向输送、在保证药物治疗作用的前提下减少给药剂量,降低药物毒性等优点[6]是解决办法之一。明胶是天然高分子生物材料,组织相容性好,可被组织吸收；在未吸水前耐高温,可高温消毒；吸水膨胀软化后,溶点不超过30℃,具有廉价易得、无抗原性、摩擦系数低、在体内可自然降解等优点,已广泛用于多种药物剂型中[7]。明胶是氨基酸与肽类交联形成的直链聚合物,能进行多种表面修饰及反应,制备时可根据不同要求设计。而且明胶中含有RGD生物活性短肽有利于细胞表面粘附分子识别。
　　微球制备采用改良的乳化冷凝法,其机制是等电点为5.0 的酸性明胶在水中溶解后,分子伸展为纤维状,在冷冻脱水的条件下卷曲,并由多个分子凝聚成球状微粒,在固化剂(戊二醛) 的作用下,明胶分子呈稳定性良好的三维网状结构,并与荷电性相反的碱性bFGF 通过离子间的相互作用形成较为稳定的PECs[8],两者间形成一定的亲和力,bFGF 被明胶吸附并包裹于微球中,随着明胶的降解,实现bFGF在体内的控制释放。而且在冻干过程中，明胶还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，从而保护因子活性. 明胶微球为实体微粒,被包裹药物释放相对缓慢,足以达到缓释的要求[9]。
　　实验结果显示复合bFGF、VEGF 缓释微球对内皮细胞数量和活力影响：空白对照组的微球成分对内皮细胞数量和活力无影响,缓释载体安全可靠。培养1天后各组细胞计数、吸光度(A)值差异无显著性；5天后复合缓释微球组细胞计数、吸光度(A)值明显高于对照组；7天后复合缓释微球组值仍高于其他组。结果表明使用bFGF、VEGF的最初24h内作用不明显；培养初期缓释微球组释放的bFGF、VEGF数量较少,促细胞增殖作用较对照组差异性不大,培养5天后,缓释微球组持续释放具有生物活性的bFGF、VEGF,而且在他们的协同作用下促增殖作用最强；培养7天后,虽然缓释微球组仍在释放bFGF、VEGF,虽然速度已经减慢且此前缓释出的部分bFGF、VEGF 生物活性遭到破坏,但其释放出的生长因子仍有促增殖作用,两种因子协同作用效果明显。
　　由于多肽的不稳定性,研究中如何保证生长因子持续高效作用是研究的难点之一,应用微球系统控制缓释多肽类药物是目前较为简单有效和安全的办法。如何提高微球的载药量,延长药物的持续释放时间及如何与其他组织工程支架复合修复重建组织损伤还需要进一步深入研究。此外多种生长因子联合应用的选择与应用的比例及时间策略也需要更加深入的探究。
　　
　　[参考文献]
　　[1]SaadehPB, Mehrara BJ, Steinbrech DS , et al. Mechanisms of fibroblast growth factor-2 modulation of vascular endithelial growth factor expression by osteoblastic cell[J]. Endocrinology, 2000, 14:2075-2083.
　　[2]Seghezzi G, Patel S, Ren CJ, et al. Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) induces vascular expression in the endothelial cell of forming capillaries: an autocrine mechanism contributing to angiogenesis[J]. Cell Biol,1998, 141:1659-1673.
　　[3]Eriksson K, Magnusson P, Dixelius J, et al. Angiostatin and endostatin inhibit endothelial cell migration in response to FGF and VEGF without interfering with specific intracellular signal transduction pathways[J]. FEBS Lett, 2003,536:19-24.
　　[4]Tokuda H , Hirade K, Wang X, etal . Involvement of SAPKPJNK in basic fibroblast growth factor2induced vascular endothelial growth factor release in osteoblasts[J]. Endocrinol, 2003,177:101-107.
　　[5]薛斌,贺光照,黄崇本. VEGF 和bFGF 联合应用促进缺血皮瓣存活的研究[J]. 重庆医学,2003,32:564-565.
　　[6]Nimni ME. Polypeptide growth factors:targeted delivery systems[J]. Bio Materials,1997,18 :1201-1225.
　　[7]Yamamoto M, Ikada Y, Tabata Y. Controlled release of growth factors based on biodegradation of gelatin hydrogel[J]. J Biomer Sci Polym Ed,2001,12 :77-88.
　　[8]Rita C , Elisabetta E , Maria O. Dextran cross- linked gelatin micro2 spheres as a drug delivery system[J]. European J Pharm and Biopharm, 1999,47:153.
　　[9]隋继强,韩 岩,吴 红,等. 人表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子纳米缓释剂对成纤维细胞的影响[J]. 中国美容医学,2006,15(12):1342-1345.
　　
　　[收稿日期]2007-08-15[修回日期]2007-11-02
　　编辑/张惠娟