增生性瘢痕 治疗_ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄｓ通路与增生性瘢痕肌成纤维细胞分化

　　临床上常见皮肤增生性瘢痕的挛缩影响皮肤的正常外观和功能，是皮肤整形外科后期治疗的一大难题。这种挛缩是由肌动蛋白为主要成分的微丝和细胞内游离钙离子等构成的非肌性细胞收缩系统作用的结果。在挛缩过程中，瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)分化，进而构成细胞内收缩系统，带动胞外胶原纤维位移使瘢痕发生挛缩。肌成纤维细胞胞浆内含有丰富的肌动蛋白微丝，称为平滑肌肌动蛋白a(a－SmoothMuscle Actin，a－SMA)。后来的研究发现，肌成纤维细胞是成纤维细胞在创伤愈合或挛缩过程中的一种终极表型，转型的过程中表达其特征性蛋白a－SMA。成纤维细胞的分化受到许多因素的影响，而其中TGF－β/smads通路对增生性瘢痕挛缩过程中肌成纤维细胞的分化起重要的作用。本文综述如下。
　　
　　1　TGF－β/Smads通路的组成
　　
　　TGF－β/Smads通路的特点是其受体具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，因此又被称为受体藕联丝氨酸/苏氨酸激酶信号转导途径。转导信号分子主要有TGF－β超家族、TGF－β受体家族及其受体底物Smad蛋白家族。TGF－β是一个分泌性的多肽信号分子，广泛存在于从线虫到哺乳动物中。最早于1978年，Delarco等在小鼠肉瘤病毒转化的细胞条件培养基中鉴定出SGF(Sarcoma Growth Factor)，因其具有转化细胞特性，又被称为转化生长因子(Transforming Growth Factor，TGF)，包含两个部分：α和β。二者在分子组成、受体结构和生物学活性上有很大差异，分属不同的蛋白家族。TGF－β超家族主要包括TGF－βs、激活素(Activins)、抑制素(Inhibins)、骨形态形成蛋白(BoneMorphogenetic Proteins，BMPs)、生长和分化因子(Growth and Differentiation Factor，GDFs)等几大类40多个成员(见表1)，其中研究最多的TGF－βs有六种异构形式，哺乳动物体内只有TGF－β1－TG－β3。

　　TGF－β受体家族包含五型，其中哺乳动物含有7种Ⅰ型受体和5种Ⅱ型受体。TβRI、TβRII可通过其结构区分，如TβRI有一个短的胞内片段和一个与激酶区域紧紧相连的GS区域。在这段约30个氨基酸的区域中包含一个甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的序列TISGSGSG，Gs区域的磷酸化和TβRⅠ、TβRⅡ的激活在TGF－β信号中有非常重要的作用。除Ⅰ、Ⅱ型信号转导功能性受体外，Tβ RⅢ(也称辅助受体，包括B－glycan和Endoglin)等不参与TGF－β信号转导。TβRⅢ是由853个氨基酸组成的蛋白多糖，具有特征性的膜镶嵌结构，不含胞内信号模体，可作为TGF－β的胞外储存库，增强TGF－β与信号受体的结合。
　　TβRⅠ的直接底物是Smad蛋白，是将配体与受体作用的信号由细胞浆转导至细胞核的中介分子。1995年Sekelsky等在寻找果蝇(Drosophilamelanogaster)Dpp的下游转导分子时，发现了Mad(Mother against dpp)及Medea基因，1996年Savage等研究尼采蝇(Caenorhabditis elegans)时发现了相同功能的Smad基因，两者合称为Smad(Sma and Mad Homologue)蛋白家族。迄今在人类已发现9个与Mad及Sma同源的基因(Smad1－Smad9)，分为三类：①受体调节型Smad(Receptor activated Smad，R－Smad)：包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad9；②共同介质型Smad(Common Smad，Co－Smad)：哺乳动物中仅有Smad4；③抑制型Smad(Inhibitory Smad，I－Smad)：包括Smad6、Smad7。
　　
　　2　TGF－β/Smads通路信号转导途径(图1)
　　
　　TGF－β/Smads通路主要有三个步骤：①TGF－β超家族信号的跨膜转导；②TGF－β超家族的细胞浆内信号转导；⑨TGF－β超家族的细胞核内信号转导。

　　首先，TGF－β超家族配体以无活性的方式分泌，经TGF－ｖ激活激酶(TGF－β，ActivatedKinase)激活后与具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的受体TβRⅡ结合形成异二聚体。TβRⅡ自动磷酸化后被TβRⅠ识别并形成TβRⅠ、TβRⅡ和TGF－β配体组成的受体异聚体复合物。TβRI的GS结构域发生磷酸化后激活丝氨酸/苏氨酸激酶，并使TβRⅠ空间结构发生改变。此过程中TβRⅢ(β－glycan)可参与发挥增强TGF－β同信号受体的结合。然后，活化的TβRⅠ依次磷酸化Smad2、Smad3羧基端的SSXS模体，从而激活Smad2、Smad3，TβRⅠ的L45环与Smad2、Smad3的MH2区，　1.3环决定了Smad2、Smad3是TβRⅠ的唯一底物。活化的Smad2、Smad3与Smad4的MH1和MH2介导形成同源异型复合体(可能是三聚体形式)。 R－Smad(Smad2和Smad3均属此类)可被一种膜藕联相关蛋-白Smad受体激活相关蛋白(Smads Anchor forReceptor Activation，SARAs)与受体异聚体复合物结合。R－Smad为－含FYVE区的膜藕联蛋白，FYVE区含两个锌指状模体，与三磷酸肌醇结合而将SARAs锚向内涵体膜上，SARA通过其Smad结合区和C端分别与R－Smad和TβRⅠ结合。随后SARA与R－Smad和受体的结合力下降并解离，再与胞浆中别的R－Smad分子结合，起递呈R－Smad的作用。激活后的R－Smad与Smad4形成R－Smad/Smad4复合物，可携带信号转位到细胞核。
　　R－Smad/Smad4复合物易位于细胞核后，通过Smad4、Smad3 MH1区的发夹样结构，与DNA上的Smad蛋白结合元件(Smad Binding Element，SBE)5’－GTCTAGAC－3’直接结合。这种结合很松散，在局部一些转录共激活因子和/或共抑制因子的影响下，Smad可能通过NH2区的转录激活序列与靶基因上游的增强子、抑制子或启动子结合，促进Smad与DNA的紧密结合并增强转录活性。另外，Smad可通过与DNA结合蛋白相互作用来调节基因的转录，如Smad2、Smad4参与激活素反应因子(ARF)的形成，ARF与DNA结合元件FAST－1的羧基端部分结合，作用于Mix.2基因的启动子，调节Mix.2基因的转录。
　　在TGF－β/smads通路中Smad6、Smad7通过与 Smad2、Smad3竞争性相结合TβRⅠ以及干扰Smad2、Smad3和Smad4的结合来抑制TGF－β信号的传导。Smad4在信号转导过程中起瓶颈的作用。
　　
　　3　TGF－β/Smads通路与增生性瘢痕肌成纤维细胞分化
　　
　　TGF－β是非常保守的细胞因子，在胚胎发育、细胞周期、细胞分化、造血调控、免疫调节、创伤修复、炎症反应等诸多领域均有重要作用，尤其在组织修复和纤维变性中，TGF－β是关键的介质。它广泛存在于各种正常细胞及转化细胞中，对于成纤维细胞的主要作用是刺激细胞分裂与分化。
　　目前已有大量证据表明TGF－β/Smads诱导成纤维细胞的分化，表达a－SMA蛋白。成纤维细胞a－SMA基因启动子序列中存在两个SBE区域，Smads蛋白与之结合后激活细胞，表达a－SMA，即完成成纤维细胞向肌成纤维细胞的转型分化。PAI－1、I型胶原和PDGF－B链等许多蛋白基因的启动子发现都含有SBE，在Smad7的启动子中也有SBE回文序列，表明Smad不仅被多种蛋白调节，同时Smad本身可形成反馈抑制环。
　　在TGF－β/Smads通路中影响成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的最主要因子是TGF－β，及其下游Smad3分子。近来又发现了非Smad3依赖的TGF－β信号诱导肌成纤维细胞的分化。Adam等在a－SMA基因肩动子序列中发现了一个TGF－β调控位点(TGF－β Control Element，TCE)，提出TGF－β本身可以直接参与到MFB的分化。Tomasek等研究认为除了TCE外，TGF－β还作用于内源性的CArG[cc(A/T)6GG]控制元件调控成纤维细胞的分化。
　　
　　除了TGF－β外，TGF－β超家族中的其他成员也发挥诱导成纤维细胞分化的作用，如BMP4通过Smad1和JNK通路诱导胎儿的成纤维细胞向MFB表型分化，BMP受体Ⅱ(BMPRII)的突变会引起Smad蛋白不能磷酸化，进一步影响成纤维细胞的增殖与分化。
　　
　　4　其他影响因子
　　
　　有人研究认为TGF－β1诱导成纤维细胞表达a－SMA必需在细胞外基质(Extra CellularMatrix，ECM)中含有ED－A序列的纤维粘连蛋白(Fibronectin，FN)，FN的沉积要先于a－SMA的表达，故含ED－A序列的FN和ECM是影响肌成纤维细胞分化的重要影响因子之一。成纤维细胞通过整合素与细胞外基质相互传递信息，在细胞外基质作用过程中，整合素可以通过粘着斑激酶(FocalAdhesion Kinase，FAK)的激活，将生物信号由胞膜传向胞核，促进a－SMA基冈的表达使成纤维细胞合成大量a SMA并向肌成纤维细胞转化，通过胞内外收缩系统的形成和收缩引起瘢痕的挛缩。细胞内收缩系统受到的机械张力对细胞增殖和基因表达的调节也是影响肌成纤维细胞分化的重要因素。
　　另外，有人观察到到皮肤伤口愈合时，感觉神经末梢释放的神经肽可通过激活肥大细胞脱颗粒上调a－SMA的表达，体外培养的巨噬细胞PDGFmRNA的转录有伤后6小时和伤后六七天两个高峰，正是成纤维细胞增殖期和肌成纤维细胞形成期。可见巨噬细胞对肌成纤维细胞表达的调控也有着重要的意义。Y－下扰素可减少成纤维细胞的a－SMA的表达，并且其呈剂量依赖性地抑制纤维连接蛋白ED－A在转录水平的合成。此外，有报道碱性成纤维细胞生长因子也可直接抑制TGF－β，诱导的肌成纤维细胞中a－SMA的合成。
　　
　　5　展望
　　
　　皮肤增生性瘢痕挛缩的组织中大量表达肌成纤维细胞标志性蛋白a－SMA，大多数学者认为肌成纤维细胞是增生性瘢痕挛缩的源动力。然而这种学说存在问题：不能解释a－SMA表达的最高峰与挛缩时间上的不匹配。为了完善学说，合理阐述瘢痕挛缩的机制，从成纤维细胞到肌成纤维细胞转分化的调控和影响因素研究对于挛缩机制有十分重要的意义。相信随着这方面基础、临床研究的深入，将来可以通过更多的药物、基因、分子生物学方法来减少增生性瘢痕和皮片移植后的挛缩，减少手术后的功能障碍。