硬脑膜外血肿 症状 血肿中的铁对任意皮瓣毒性作用的研究

　　[摘要]目的：探讨血肿中的铁对皮瓣的毒性作用。方法：8头4～8月龄白色小型猪，在每头猪脊柱两侧各设计6个任意皮瓣，共96个。将皮瓣随机分配进入对照组、生理盐水组、血肿组、去铁胺组，每组24个皮瓣。对照组：皮瓣形成后无其他处理；生理盐水组：在皮瓣形成后向皮瓣下注入15ml生理盐水；血肿组：在皮瓣形成后向皮瓣下注入15ml自体血液；去铁胺组：在皮瓣形成后向皮瓣下注入15ml自体血液和270mg甲磺酸去铁胺。各组分别在术后24h、72h、120h取材，检测各组术后2h皮瓣的血流情况，检测皮瓣铁含量、丙二醛(MDA)含量、髓过氧化物酶(MPO)活性。 结果：①四个组术后2h皮瓣血流灌注量无显著差别(P＞0.05)；②生理盐水组各项指标与对照组无显著差异(P＞0.05)；③血肿组术后皮瓣铁含量、MDA含量和MPO活性均高于对照组(P＜0.01)；④去铁胺组皮瓣铁含量和MDA含量低于血肿组(P＜0.01)，MPO活性与血肿组无显著差异(P＞0.05)。 结论：血肿中的铁能增强皮瓣内的脂质过氧化反应。
　　[关键词]血肿；皮瓣；毒性作用；铁
　　[中图分类号]R622[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）05-0770-04
　　
　　Study on the toxic effects of iron in hematoma on random skin flap
　　XIE Xiang1，ZHUANG Hong-xing2, LI Dong3
　　(1.Shangdi Outpatient of the Third Hospital of Beijing University, Beijing 100084,China; 2.Auricular Reconstruction Center of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical Collage;3. Department of Plastic Surgery, The Third Hospital of Beijing University）
　　
　　Abstract:ObjectiveTo explore the toxic effects of iron in hematoma on random skin flap.MethodsEight 4～8-month-aged white minipigs were selected. 12 random skin flaps were designed on two side of vertebral column in each minipig. The total flaps were 96. The skin flaps were divided into control group,saline group, hematoma group and deferoxamine group randomly. The control group: there was no other treatment after flap formation; The saline group:15ml saline was infused into the capsules under the flaps. The hematoma group:15ml blood was infused into the capsules under the flaps. The deferoxamine group: 15ml blood and 270mg deferoxamine were infused into the capsules under the flaps. Seperately,pieces of skin flap tissue were taken from the skin flaps 24h, 72h, 120h postoperative. The blood flow of skin flaps were detected 2h postoperative. The contents of iron and malonaldehyde(MDA), the activity of myeloperoxidase(MPO) were detected.Results①The blood flow of skin flaps which were detected 2h after the operation had no significant difference among the three groups(P�0.05).②The indexes of saline had no significant difference with the control group(P�0.05).③Compared with the control group, the contents of iron and MDA and the activity of MPO in hematoma group increased(P�0.01). ④Compared with the hematoma group, the contents of iron and MDA in deferoxamine group decreased(P�0.01). The activity of MPO had no significant difference between hematoma group and deferoxamine group(P�0.05).ConclusionsIron in hematoma can strengthen the lipid peroxidation in the skin flap.
　　Key words:hematoma;skin flap;toxic effects;iron
　　
　　皮瓣是整形外科常用的修复组织缺损的手段。在皮瓣移植手术后，血肿是常见的并发症。血肿不仅会对皮瓣产生压迫使组织缺血坏死，而且会对组织产生毒性作用[1]。对皮瓣产生压迫作用的血肿常常引起注意，而血肿的毒性作用却往往被人忽视。Angel等[2-3]将多种物质放置于大鼠背部任意皮瓣下深入观察了皮瓣的存活率，其中血液能使皮瓣组织坏死显著增加，而血清则不能。在血液中加入去铁胺则显著增加皮瓣的存活率。加入硫酸亚铁的血清相对于单纯的血清能增加皮瓣的坏死量。这一实验说明铁会对于组织产生毒性作用，导致皮瓣坏死。本研究通过猪背部的任意皮瓣下血肿模型，探讨血肿中铁离子对皮瓣损害的机制。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 主要实验材料
　　1.1.1 实验动物：4～8个月龄白色小型猪(香猪)共8只，体重16～25kg，由北京农业大学动物研究中心提供。
　　1.2.1 主要试剂和药品：铁标准溶液（国家标准物质中心产品），甲磺酸去铁胺（北京诺华制药有限公司），丙二醛测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，髓过氧化物酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 实验分组：8头白色小型猪，在每头猪脊柱两侧设计12个术区，形成4cm×6cm大小的任意皮瓣。8头猪共96个皮瓣。遵循随机化原则，把皮瓣分为四个组，分别为对照组、生理盐水组、血肿组、去铁胺组，每组24个皮瓣。对照组：皮瓣形成后无其他处理；生理盐水组：皮瓣形成后向皮瓣下注入15ml生理盐水；血肿组：在皮瓣形成后向皮瓣下注入15ml自体血液；去铁胺组：在皮瓣形成后向皮瓣下注入15ml自体血液和270mg甲磺酸去铁胺。
　　1.2.2 动物模型的制备
　　1.2.2.1手术设计：应用氯胺酮（首次麻醉剂量12mg/kg, 全麻维持量为6mg/kg/30min）、速眠新（首次麻醉剂量0.08ml/kg, 全麻维持量为0.04ml/kg/30min）进行麻醉。在猪一侧的耳缘静脉上建立静脉通路，给予0.9%NaCl缓慢维持滴注，维持循环血量，并在术中间断给予青霉素、东蓑若碱等药物。术区均用0.5%碘伏消毒2遍。在小型猪的脊柱两侧分别设计6个任意皮瓣，大小为4cm×6cm。
　　1.2.2.2 手术操作：用0.5%利多卡因局部浸润麻醉，依照设计切开皮肤，形成4cm×6cm 的任意皮瓣，蒂在脊柱侧。皮瓣缝合前在皮瓣下置入注液导管，以便注入血液和药物。
　　1.2.2.3 取血方法：待皮瓣制作完成后，开始抽取小型猪的血液。于颈部侧前方做切口，用组织剪钝性分离下方的筋膜组织和肌层，即可显露直径约8mm的颈外静脉，1号线结扎静脉的近心端后，静脉变粗，用20ml注射器刺入静脉抽血，最多可抽出静脉血70ml。还可从猪的后肢内侧浅表静脉抽血，方法如下：用备皮刀刮除局部猪毛，观察静脉走行，选择较粗且直的血管，75%酒精消毒，助手用力压住静脉近心端，术者拍打静脉，用10ml注射器穿刺血管抽血，此法能抽出静脉血25ml。
　　1.2.2.4 通过留置的导管向生理盐水组皮瓣下注入15ml生理盐水；向血肿组皮瓣下注入15ml血液；向去铁胺组皮瓣下注入15ml血液和270mg甲磺酸去铁胺，拔出注液导管时，预留缝线打结，防止注入的血液外溢。
　　1.2.3 取材：各组分别在术后24h、72h和120h于皮瓣中央切取1cm×1.5cm大小的全层皮瓣，每组每个时间点取8个皮瓣。所取组织保存于-70℃冰箱中。
　　1.2.4 检测指标和方法
　　1.2.4.1皮瓣血流灌注量检测：每组随机选8个皮瓣，于术后2h采用PIM-II型激光多普勒血流量图像仪检测皮瓣的血流情况。方法如下：小型猪侧卧位，用棉垫垫高猪的背部，使皮瓣与地面平行，取皮瓣中心为扫描中心，激光探头与皮瓣的垂直距离为15cm，扫描范围30×30像素，读取血流灌注量（电压值为V），并取三次测量的平均值。
　　1.2.4.2 皮瓣中铁离子含量测定：选择标本中没有皮瓣内出血的部位，取全层皮瓣进行检测。样品置于50ml锥形瓶中，加入防爆玻璃珠5个，加入V(硝酸):V(高氯酸混合酸)(4:1)10ml，上端放一歪嘴漏斗，放置12h进行消化。电热板缓慢升温，升温到200℃～250℃，持续加热至白烟散尽，此时溶液接近无色，蒸近干，稍冷却，加约5ml去离子水，再加热，蒸除余酸，冷却。用去离子水冲洗三角瓶及歪嘴漏斗，将消化好的样品溶液转入25ml容量瓶中，定容至25ml，摇匀待测。用火焰原子吸收法测定皮瓣中铁含量。
　　1.2.4.4 丙二醛含量及髓过氧化物酶活性的测定：术后24h、72h和120h于皮瓣中央切取全层皮瓣组织，称重。按重量体积比为1:19加入匀浆介质，冰水浴中匀浆，制成10%组织匀浆液, 依照丙二醛(malondialdehyde, MDA)测定试剂盒（硫代巴比妥酸法）和髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)测定试剂盒说明书步骤，测定所取皮瓣组织MDA含量及MPO活性，皮瓣组织中蛋白含量用考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒定量。
　　1.2.4.9 统计学处理：数据用x±s表示，应用SPSS13.0 软件对数据进行方差分析，P 　　本实验中对照组皮瓣铁含量在术后72h时较24h有所升高，术后120h时又有所下降。血肿组皮瓣铁含量在术后24h就高于对照组，术后72h的皮瓣标本中铁含量较术后24h显著增加，到术后120h时也没有明显降低，与对照组相比明显升高。造成这一结果的原因可能是血肿中部分红细胞破裂，释放出的血红蛋白分解产生铁离子，使血肿组术后24h皮瓣铁含量较对照组升高。而在术后72h红细胞大量溶解，血红蛋白分解产生铁离子进一步增多，就使皮瓣的铁含量进一步升高。去铁胺组皮瓣中铁含量在术后24h、72h和120h时均显著低于血肿组，术后72h的铁含量甚至低于对照组。这一结果说明去铁胺结合了血红蛋白分解释放出的铁，阻止了血肿造成的皮瓣铁含量升高。
　　在狗的动物模型中发现脑出血后局部血红蛋白的浓度2天后达到高峰[7]，这说明红细胞溶解的时间是2天左右。红细胞溶解后释放出大量血红蛋白（Hemoglobin,Hb），来自Hb的血红素可被血红素氧合酶分解为铁、一氧化碳和胆绿素[8]，铁是在血肿形成后3天大量游离出来发的。这与我们实验中观察到的术后3天皮瓣铁含量达到高峰是一致的。铁离子的延迟释放说明血肿中铁对皮瓣的损害是逐渐加重的，这就为治疗这种损伤提供了充足的时间。如能在血肿形成后1天内局部应用去铁胺，就能明显减轻铁离子造成的损害。
　　3.3 关于MDA含量检测：组织中大量的铁不仅会使局部组织抗菌能力下降，而且会产生自由基等毒性物质[9]：①组织中的游离铁催化巯基化合物的自氧化作用，促使O2-和H2O2的生成；②通过Haber - Weiss反应产生自由基，形成高毒性羟自由基；③与O2-作用生成高活性的高铁酰和铁酰自由基复合；④催化脂氢过氧化物均裂产生ROO・和RO・，引发新的脂质过氧化的链式反应，分解代谢产生毒性醛。
　　本实验观察到在对照组的皮瓣中，MDA的含量在术后72h时达到高峰，120h时有所下降；而血肿组皮瓣的MDA含量在术后72h时达到高峰，120h时仍维持在很高的水平，与72h时的含量无显著差异。在术后24h时，MDA含量在两组间无显著差异；血肿组术后72h和120h的皮瓣MDA含量都显著高于对照组。这些结果说明血肿形成初期（24h内），血肿并没有使MDA含量升高，皮瓣的脂质过氧化反应没有因血肿的存在而加重。而此时血肿组皮瓣铁含量已较对照组升高。随着时间的延长，血肿组72h和120h时皮瓣内的MDA含量显著增高，与对照组相比有显著性差异，此时血肿组皮瓣铁含量较对照组明显升高。这一结果显示，血肿组皮瓣中铁含量先升高，随后出现了MDA含量升高，这说明是血肿中的铁离子使皮瓣内自由基增多，组织的脂质过氧化反应加重，尤其是在术后120h时，铁含量和MDA含量都居高不下，表明血肿形成不但增加了皮瓣组织的铁含量使脂质过氧化反应增强，而且延长了这种损害的时间。在去铁胺组中，在术后72h和120h铁含量和MDA含量比血肿组显著降低，铁含量与对照组无显著性差异，但MDA含量仍较对照组升高。这说明去铁胺结合了从血肿中释放出的铁，完全抑制了皮瓣铁含量增高，但是没有完全抑制MDA含量的升高，这表明血肿中还有其他物质使MDA含量升高。总之，局部应用去铁胺能显著降低皮瓣组织的铁含量和MDA含量，有效减轻脂质过氧化反应，对血肿上的皮瓣起到保护作用。
　　3.4 关于MPO活性检测：本实验选用了MPO活性作为皮瓣炎症反应程度的指标。MPO是主要存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中的一种酶，约占细胞干重的5%，在中性粒细胞中有很高活性，激活的中性粒细胞能释放大量的MPO到细胞外液中。因此，MPO是中性粒细胞渗入皮瓣组织程度的酶标，它反映组织炎症程度[10]。
　　本实验观察到对照组的皮瓣中，MPO活性在术后72h时达到高峰，120h时有所下降；而血肿组MPO活性于术后72h时达到高峰，120h时仍维持在很高的水平，与72h时的含量无显著差异。血肿组术后24h、72h和120h的皮瓣MPO活性都显著高于对照组。这些结果说明血肿形成初期（24h内），血肿就使MPO活性升高，皮瓣的炎症反应因血肿的存在而加重。而随着时间的延长，血肿组术后120h时皮瓣内的MPO活性仍维持在很高水平，这说明血肿中的某些因素使皮瓣内白细胞浸润增多，组织的炎症反应加重，尤其是在术后120h时，MPO含量仍居高不下，表明血肿形成不但增强了皮瓣组织的炎症反应，而且延长了炎症反应的时间。去铁胺组在术后24h、72h和120h皮瓣的MPO活性与血肿组相比无统计学差异。这说明去铁胺作为一种铁离子络合剂和自由基清除剂，对皮瓣的MPO活性无明显影响，不能明显减轻炎症反应。
　　本实验通过小型猪背部任意皮瓣下非张力性血肿模型，观察到血肿能使皮瓣内铁含量增高、脂质过氧化反应增强、炎症反应增强。局部应用去铁胺能抑制血肿导致的脂质过氧化反应增强，去铁胺的这种作用主要是通过降低皮瓣中铁含量而实现的。去铁胺的应用不能减轻炎症反应，说明炎症反应是由其他因素导致的，需要进一步研究。
　　
　　[参考文献]
　　[1]王炜.整形外科学[M].杭州：浙江科学技术出版社,1999:293-323.
　　[2]Angel MF,Haddad J, Abramson M. A free radical scavenger reduced hematoma-induced necrosis in Fischer rats[J]. Otolaryngol Head Neck Surg,1987,96: 96-98.
　　[3]Angel MF, Narayanan K, Swartz WM, et al. The etiologic role of free radicals in hematoma-induced flap necrosis[J].Plast Reconstr Surg,1986,77:795-803.
　　[4]陈铭,徐长军,秦建兵,等.红细胞对脑出血后脑水肿的影响及去铁胺的作用[J]. 中华神经外科疾病研究杂志,2005,4:265-266.
　　[5]王京娥,张勇,丁新生,等. 二异丙酚对脑出血大鼠脑组织NF-κB表达及超微结构的影响[J].中国脑血管病杂志,2007,4(4):172-176.
　　[6]Ward CG, Bullen JJ, Rogers HJ. Iron and infection: new developments and their implications[J]. J Trauma,1996,41: 356-364.
　　[7]Marlet JM,Barreto Fonseca Jde P,et al. Experimental determination of time of intracranial hemorrhage by spectrophotometric analysis of cerebrospinal fluid[J].J Forensic Sci,1982,27: 880-888.
　　[8]Matz P,Weinstein PR,Sharp FR. Heme-oxygenase-l and heat shock protein 70 induction in glia and neurons throughout rat brain after experimental intracerebral hemorrhage[J]. Neurosurgery, 1997,40:152-162.
　　[9]钱忠明.铁代谢-基础与临床[M].北京: 科学出版社,2000:293-305.
　　[10]Bradley P,Priebat DA,Christensen RD,et al. Messurement of cutancous inflammation: estimation of neutrophil content with an enyme maker[J].J Invest Dermatol,1998,78:206-209.
　　
　　[收稿日期]2011-03-15[修回日期]2011-04-21
　　编辑/张惠娟
　　 注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”