【6-O-羧甲基壳聚糖对人增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1表达的影响】 羧甲基壳聚糖

　　[摘要]目的：观察不同浓度6-O-羧甲基壳聚糖（6-O-CMC）对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞（hypertrophic scar fibrob lasts，HSFBs ）转化生长因子-β1 (transforming growth factor-beta1，TGF-β1) 蛋白及mRNA表达的影响，在分子水平上探讨其抑制增生性瘢痕生长的作用机制。 方法：体外培养人HSFBs，选取第3～5代细胞进行下一步实验。实验分组采用含不同浓度6-O-CMC（0，100，200，400μg/ml）的DMEM培养液分别进行培养。培养24h后，显微镜下观察各组HSFBs形态及生长情况。收集细胞培养上清，运用双抗体夹心ELISA法检测各组TGF-β1蛋白表达水平。运用荧光定量RT-PCR技术检测各组TGF-β1 mRNA表达水平。 结果：与空白组相比，三个药物剂量组HSFBs TGF-β1蛋白及mRNA的表达均减少（P 　　1.3HSFBs的原代及传代培养：称取手术切除的增生性瘢痕组织块约5g，去除表皮及皮下脂肪，在无菌条件下漂洗、消毒，留白色质韧真皮胶原组织备用。原代培养采用组织块培养法，具体方法参照文献[5-6]进行，待细胞融合至80%时，常规消化、传代。实验选用第3～5代细胞。
　　1.46-O-CMC对HSFBs生长及形态的影响：以2×105个/ml的细胞密度分别接种于24孔培养板，每孔1ml，37℃、5%CO2培养箱中培养12h后，按分组加入不同浓度的培养液，继续培养24h，在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。
　　1.5 ELISA法测定TGF-β1蛋白表达水平：以1×106个/ml的细胞密度分别接种于6孔培养板，每孔2ml，37℃、5%CO2培养箱中培养12h后，按分组加入不同浓度的培养液。继续培养48h后收集培养上清。双抗体夹心ELISA法检测TGF-β1蛋白水平，严格按照试剂盒说明书测定吸光度并绘制标准曲线。
　　1.6 引物设计与合成（上海生工生物技术有限公司完成）：
　　TGF-β1：上游引物：5"-ACCGGCCTTTCCTGCTTCT-3"；下游引物：5"-GGTCCTTGCGGAAGTCAATGT-3"；产物长度：156bp。
　　内参β-actin：上游引物：5"-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3"；下游引物：5" -CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3"；产物长度：205bp。
　　1.7 总RNA的提取：以1×106个/ml的细胞密度分别接种于6孔培养板，每孔2ml，37℃、5%CO2培养箱中培养12h后，按分组加入不同浓度的培养液。继续培养48h ，应用Trizol试剂盒提取的总RNA（方法按说明书进行）；并用紫外分光光度计定量，A260/A280值≥1.8的进入下一步实验。
　　1.8 荧光定量PCR 扩增：逆转录反应（合成cDNA）严格按照试剂盒操作说明进行；PCR 扩增反应体系(20μl) ：SYBR Premix Ex Taq II（10μl），PCR Forward Primer (0.8μl)， PCR Reverse Primer(0.8μl)， dH2O (6.4μl)， cDNA (2μl)。反应条件：95℃30s，95℃5s， 60℃45s，共40 个循环。
　　以β-actin为内参照，采用相对定量法，利用Ct值计算TGF-β1mRNA 的相对量。
　　用荧光定量PCR常用公式进行运算：
　　相对表达量=2-△△Ct
　　其中：△△Ct=[CT（待测基因）-CT（待测组β-actin）]-[CT（对照基因）-CT（对照组β-actin）]
　　1.9统计学方法：数据用SPSS 18.0 统计软件处理，计量资料用表示；所有浓度组之间运用单因素方差分析进行比较，各组间两两比较采用最小显著性差异法（Least Significant Difference，LSD法），P 　　[2]谢举临,利天增,祈少海,等. 转化生长因子β1对培养的瘢痕成纤维细胞增殖的调控作用[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2006,15(1):30-33.
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　　[收稿日期]2010-11-03[修回日期]2011-01-13
　　编辑/张惠娟