食用油中苯并(a)芘快速检测,胶体金免疫层析法(KJ201910)
来源:造价师 发布时间:2020-11-16 点击:
附件10 食用油中苯并(a)芘的快速检测 胶体金免疫层析法 (KJ201910) 1 范围 本方法规定了食用油中苯并(a)芘的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于食用油中苯并(a)芘的快速测定。
2 原理 本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苯并(a)芘经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合,抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线(T线)上抗原的结合,从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线(C线)颜色深浅比较,对样品中苯并(a)芘进行定性判定。
3 试剂和材料 除另有规定外,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂 3.1.1 正己烷:色谱纯。
3.1.2 乙腈:色谱纯。
3.1.3 二甲基亚砜(DMSO)。
3.1.4 NaH2PO4•2H2O。
3.1.5 Na2HPO4•12H2O。
3.1.6 氯化钠。
3.1.7 吐温-20。
3.1.8 氢氧化钠溶液(2 mol/L):称取80g氢氧化钠用水溶解,并定容至1L。
3.1.9 PBST溶液:称取0.2965 g NaH2PO4•2H2O、2.9 g Na2HPO4•12H2O、8.76 g氯化钠与0.55 g吐温-20用水溶解并定容至1 L。
3.2 参考物质 苯并(a)芘参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1,纯度均≥95%。
表1 苯并(a)芘参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子质量 苯并(a)芘 Benzo(a)pyrene 50-32-8 C20H12 252.32 注:或等同可溯源物质。
3.3 标准溶液的配制 苯并(a)芘标准储备液(0.1 mg/mL):精密称取适量苯并(a)芘标准品(3.2),置于10 mL容量瓶中,用乙腈(3.1.2)溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度为0.1 mg/mL的苯并(a)芘标准储备液;
或可直接购买苯并(a)芘标准储备液。0 ℃~5 ℃避光保存备用,有效期1年。
3.4 材料 苯并(a)芘胶体金免疫层析试剂盒,适用基质为食用油。
3.4.1金标微孔(含胶体金标记的特异性抗体)。
3.4.2 试纸条或检测卡。
4 仪器和设备 4.1 移液器:100 µL、1 mL、5 mL和10 mL。
4.2 涡旋混合器。
4.3 离心机:转速≥4000 r/min。
4.4 电子天平:感量为0.01 g。
4.5 氮吹仪或空气吹干仪(带温度控制)。
5 分析步骤 5.1 试样制备 取适量有代表性样品充分混匀。
5.2 试样提取和净化除脂 称取10 g油样于离心管中,加入5 mL 正己烷(3.1.1)和15 mL DMSO(3.1.3)并混合均匀。漩涡振荡2min,然后4000 r/min离心2 min。弃去上层正己烷层。加入5 mL 正己烷(3.1.1),漩涡振荡30 s,然后4000 r/min离心30 s。弃去上层正己烷层。加入10 mL 氢氧化钠溶液(2 mol/L)(3.1.8)和15 mL正己烷(3.1.1),漩涡振荡30s,然后4000 r/min离心30 s。吸取上层正己烷层于15 mL离心管,4000 r/min离心2 min。取全部正己烷层于氮吹管中,50℃氮吹或空气吹10 min,吹干后加入200μL DMSO(3.1.3)复溶,混合均匀,此为待测液。
5.3 测定步骤 打开试纸筒,取出所需数量的红色反应微孔(取出微孔后,立即盖好桶盖,以防受潮)。往微孔中加入200 μL的PBST溶液,再加入50 μL待测液,上下抽吸5~10次至微孔试剂混合均匀,室温(20℃~25℃)反应7 min。将已做好标记的试纸条插入至上述红色微孔中,使样品垫充分进 入样品中,并计时7 min。从微孔中取出试纸条,弃去试纸条下端的样品垫,进行结果判定。
5.4 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。
5.4.1 空白试验 称取空白试样,按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
5.4.2 加标质控试验 准确称取空白试样(精确至0.01 g)置于玻璃试剂瓶中,加入一定体积的苯并(a)芘标准储备液(0.1 mg/mL)(3.3.1),使试样中苯并(a)芘浓度为10 μg/kg,按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
6 结果判定方式 由于长时间放置会引起质控线(C线)与检测线(T线)颜色的变化,需在规定时间内进行结果判定。试纸条与检测卡如图1所示。结果判定也可根据产品说明书进行。
6.1 读数仪测定结果 通过读数仪对结果进行判读,根据不同厂家仪器规定进行判读。
无效:质控线(C线)不显色,无论检测线(T线)是否显色,均表示实验结果无效。
阳性:若检测结果显示“+”(阳性),表示试样中含有待测组分且其含量大于等于方法检出限。
阴性:若检测结果显示“-”(阴性),表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限。
6.2 目视判定 通过对比质控线(C线)和检测线(T线)的颜色深浅进行结果判定。
无效:质控线(C线)不显色,无论检测线(T线)是否显色,均表示实验结果无效。
阳性:质控线(C线)显色,若检测线(T线)不出现或出现但颜色浅于质控线(C线),表示试样中含有待测组分且其含量高于方法检出限,判为阳性。
阴性:质控线(C线)显色,若检测线(T线)颜色深于或等于质控线(C线),表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限,判为阴性。
6.3 质控实验要求 空白试验测定结果应为阴性,加标质控试验测定结果应为阳性。
C T S C S T C T S C T S C T S C T S 加样孔 无效 阴性 阳性 B.检测卡 吸水纸 NC膜 样品垫 无效 阴性 阳性 C线 T线 A.试纸条 图1目视判定示意图 7 结论 当检测结果为阳性时,应对结果进行确证。
8 性能指标 8.1 检测限 10μg/kg。
8.2 灵敏度 ≥95%。
8.3 特异性 ≥85%。
8.4 假阴性率 ≤5%。
8.5 假阳性率 ≤15%。
注:性能指标计算方法参见附录A。
9 其他 本方法分析步骤和结果判定可以根据厂家试剂盒的说明书进行,但应符合或优于本方法规定的性能指标。
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便,在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前,须对其进行考察,应满足本方法规定的各项性能指标。
本方法参比标准为GB 5009.27-2016《食品安全国家标准 食品中苯并(a)芘的测定》。
本方法使用试剂盒可能与苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(e)芘、苯并(j)荧蒽等物质存在交叉反应,当结果判定为阳性时应对结果进行确证。
附录A 定性方法性能计算表 表A.1性能指标计算方法 样品情况a 检测结果b 总数 阳性 阴性 阳性 N11 N12 N1.=N11+N12 阴性 N21 N22 N2.=N21+N22 总数 N.1=N11+N21 N.2=N12+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 显著性差异(χ2)
χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度(df)=1 灵敏度(p+,%)
p+=N11/N1. 特异性(p-,%)
p-=N22/N2. 假阴性率(pf-,%)
pf-=N12/N1.=100-灵敏度 假阳性率(pf+,%)
pf+=N21/N2.=100-特异性 相对准确度,%c (N11+N22)/(N1.+N2.) 注:
a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。
b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。
N:任何特定单元的结果数,第一个下标指行,第二个下标指列。例如:N11表示第一行,第一列,N1.表示所有的第一行,N.2表示所有的第二列;
N12表示第一行,第二列。
C为方法的检测结果相对准确性的结果,与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。
本方法负责起草单位:广东省食品检验所。
验证单位:成都市食品药品检验研究院、中国农业科学院油料作物研究所。
本方法主要起草人:熊含鸿、王立亚、简德威、陈思敏、雷毅
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