硬腭两维牵张成骨的动物实验研究 牵张成骨

　　[摘要]目的：通过手术建立犬腭裂实验动物模型，探讨应用自行设计制作的腭骨外固定两维牵张器关闭硬腭骨裂隙和后退腭骨的可行性。方法：选择7只年龄在1～1.5岁的健康杂种犬作为研究对象。并采用随机分组的方法抽取2只为对照组，其余5只作为实验组。通过手术制造10mm×25mm的人工腭裂模型，观察对照组能否自然愈合。在实验组采用自行设计制作的硬腭两维骨牵张器，通过骨牵张关闭裂隙并延长硬腭骨，观察牵张过程。结果：实验犬术后均成活、健康状况良好，实验组牵张器固定牢靠，顺利关闭约10mm的间隙，硬腭骨延长约12mm，对照组裂隙无明显变化。结论：设计的硬腭两维牵张器，具有稳定可靠的牵张作用，可以同时关闭裂隙和延长硬腭骨，为修复腭裂提供了一种新的途径。
　　[关键词]两维牵张器；牵张成骨；腭裂修复；
　　[中图分类号]R782.5 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)06－0779－04
　　
　　先天性唇腭裂是最常见的发育畸形之一，它严重影响患者的口腔及牙颌系统的功能，传统治疗是采用腭裂修复术和咽成形术的方法来关闭软组织裂隙，但是，由于骨缺损的未能修复以及腭裂手术软组织剥离和骨面裸露及瘢痕的形成，患者往往存在着上颌发育不良和腭咽闭合不全的问题。牵张成骨术(distraction osteogenesis，DO)是应用特定的机械装置渐进性牵拉离断的骨段，从而促进新骨形成的一种技术。近年来已被应用于颅颌面外科，并且出现了许多类型的新型骨牵张器。本研究通过手术建立人工犬腭裂模型，并应用自行设计的硬腭两维牵张器，进行牵张，以期达到关闭硬腭裂隙的同时后退硬腭，缩小咽腔，改善腭咽闭合功能的目的，目前在国内外尚未见类似文献报道。本文对此进行研究分析，观察其可行性，探索一种治疗腭裂的新方法。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　实验动物及器材：1～1．5岁的健康杂种犬(第四军医大学实验动物中心提供)，性别不限，体重17～20kg，选择7只无口鼻腔病灶及呼吸系统、消化系统疾病的犬纳入实验，作为研究对象。并随机抽取2只为对照组，其余5只作为实验组。国产冠鹰骨锯、骨钻。牵张器由西安中邦生物科技公司协助研制。
　　
　　1．2　实验方法
　　1．2．1　腭裂动物模型的建立：实验动物术前8h禁饮食，以0.15ml／kg体重速眠新注射液+地西泮5mg肌注麻醉，0.5％碘伏液消毒头面部及口腔，咽腔填塞纱条以隔绝血液流入呼吸道。取双侧第三前磨牙连线经腭中线至硬腭后缘设计“工”字形切口，向两侧翻起组织瓣，注意保护位于双侧第四前磨牙腭侧之腭大神经血管束。沿矢状方向距离腭中缝两侧5mm处行骨切开，长度自硬腭后缘至双侧第三前磨牙连线水平，前端水平骨切开，以小骨凿轻轻凿开、撬动切除骨块，仔细剥离鼻腔侧粘膜，继而切除骨块后缘附丽软组织，形成10mm×25mm大小骨缺损。在鼻中隔两侧矢状方向剖开鼻腔粘膜，暴露鼻腔。按照骨缺损区的形状切除部分硬腭粘骨膜，用O号线将硬腭创缘与鼻腔粘膜相对缝合，至此，形成硬腭全层洞穿性裂隙。手术后给予肌肉注射青霉素钠160万u／天，共5天。术后1周内喂半流质食物，1周后以软食饲养，术后10天拆除伤口缝线，10周后处死动物观察干骨标本。
　　1．2．2　实验组牵张器植入：实验组动物在制造裂隙的同时将牵张器调整至牵张板位于骨转移盘所在的中心位置，钻孔并标记截骨线。在硬腭裂隙两侧10mm处由前向后以电锯做平行于裂隙的骨切开，在腭裂前方成“V”形切开，截骨角度约450与纵形截骨线相连，形成“M”截骨线。两侧对称的骨转移盘形状近似平行四边形，其中宽约10mm，长约25mm。轻轻撬动骨转移盘，将牵张器两侧固定臂置入粘膜上方并与骨面紧密贴合，将固定臂和牵张板以7mm的微型纯钛螺钉穿通粘骨膜于骨面坚固内固定。仍按照前述方法缝合伤口，术后处理与喂养与实验对照组相同，术后10天拆线，12天后开始加力进行牵张(图1、2)。
　　
　　1．2．3　实验组牵张整复：在牵张器植入手术后12天开始加力，此阶段为牵张前的间歇期。先旋转矢状转盘，后旋转水平转盘。以矢状转盘每次旋转一圈，水平转盘每次1/2圈的速度牵引，每天牵张两次，合计牵张距离为向后延长0.8mm，向近中每侧牵张0.4mm，裂隙缩小0.8mm。13天左右可关闭宽约10mm的裂隙，后退硬腭10mm。此时继续按此牵张频率单独旋转矢状转盘，向后延长硬腭。继续后退2mm后结束牵张，原位固定保持10周后处死，以4％多聚甲醛液经颈动脉灌注，取材进研究。
　　1．2．4　三维CT重建：分别在牵张前及牵张保持期后进行CT三维重建，观察硬腭骨形态改变及成骨情况。
　　1．2．5　组织学研究：标本为牵张区新生骨组织及部分正常骨组织，切割为10mm×10mm大小组织块，20％甲酸脱钙，常规脱水，石蜡包埋，沿牵张方向水平及冠状切片(0.5μm厚度)，经HF、Masson三色染后，光学显微镜观察并拍摄照片。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　牵张前观察：实验动物均顺利完成手术。术后第一天以少量流食为主，进食缓慢，容易鼻腔返流，出现喷嚏呛咳等刺激症状，吠声鼻音较重，与人类腭裂患者临床表现相似。两组动物均成活至实验结束。口内检查硬腭部分可见10mm×25mm的全层洞穿裂隙，创口无出血及感染迹象，牵张器固定牢靠，对饮食呼吸及咬合无明显影响。
　　
　　2．2　对照组观察：虽然实验犬随着对裂隙的适应，返流及呛咳现象有所好转，但术后观察硬腭部全层缺损一直保持原有大小及形态，裂隙边缘口腔粘膜与鼻腔粘膜愈合良好。10周处死后观察裂隙全层缺损仍存在，证实10mm×25mm的裂隙无法自然愈合。建立了长期稳定的犬腭裂骨质缺损的实验动物模型。
　　
　　2．3　实验组观察：术后10天拆除缝线见裂隙边缘伤口愈合良好，牵张器牢靠，可以正常牵张。牵张过程中，伤口无裂开，裂隙逐渐缩小。牵张13天后，裂隙已完全闭合，水平转盘牵张阻力明显增大，但矢状转盘仍可顺利旋转向后延长硬腭，牵张15天，硬腭延长约12mm后，停止牵张，进入保持期。此时动物进食时的鼻腔返流和呛咳现象已完全消失。咬合关系未见异常。保持期中，牵张器固定螺钉穿粘膜处有局限性坏死现象，但是经过每天螺钉周围碘伏消毒处理，发现坏死仅限于粘膜表层，对实验结果没有影响。牵张器固定良好，无松动脱落。硬腭后部裂隙已消失，仅见软腭有一直径约7mm的软组织缺损。裂隙边缘的粘膜在持续性压力作用下，已经部分粘连愈合，仅见条状瘢痕(图3)。
　　
　　
　　2．4　组织学观察：HE染色示牵张区域有沿牵张方向排列的骨小梁结构且已钙化成熟，形成较均匀一致的成熟板层骨结构，其间可见较活跃的骨改建现象，骨小梁周围有较多的成骨细胞和破骨细胞，较成熟的哈佛氏系统已经形成。Masson三色染色可见 骨小梁钙化程度较高，显示较均匀的皮质骨形态，骨小梁排列较乱。骨细胞较旧骨区域多，新旧骨交界处的界线已不明确。
　　
　　2．5　CT扫描结果：牵张完成后10周，拆除牵张器后两周，水平CT扫描可见，新生骨位于水平及矢状牵张区内，基本完全骨化，骨质密度与正常骨类似。三维CT重建可见双侧骨转移盘已转移至裂隙中央，且明显后退，但边缘较原来略有吸收，仍可见牵张器拆除后遗留的固位钉孔，新生骨略高于正常骨表面(图4)。
　　
　　2．6　大体标本观察：肉眼观察标本，见硬腭骨裂隙已经消失，硬腭结构连续。牵张区为大量新生骨样结构组织，与转移盘及硬腭骨组织连续。新生骨厚约0.5～1.0mm，较正常腭骨薄，且表面粗糙不平。
　　
　　3　讨论
　　
　　3．1　腭裂现今的治疗仍以手术修补为主，然而腭裂修复术是通过移位腭部软组织至裂隙处愈合而封闭裂隙，术后形成的瘢痕不但影响术后的腭咽闭合而且被认为是造成上颌骨发育不全的主要原因。据调查腭裂术后的腭咽闭合不全发生率为4.5％～39％。术后的语音治疗只能减少部分症状，仍以手术治疗为主，如腭延长术，咽后壁瓣咽成形术，腭咽肌瓣咽成形术。然而没有临床证据表明哪一种方法最适合于腭咽闭合不全的治疗，而且它们均是采用软组织瓣的转移，造成腭咽部生理解剖的改变，且随着各种瘢痕的产生和瓣的萎缩，很多患者术后仍遗留有严重的发音异常。目前，国内外学者利用牵张成骨技术治疗腭裂已取得一定进展。柳春明1999年首次采用记忆合金牵张犬腭骨外侧缝，成功关闭了人工形成的硬腭裂隙。梁立民在2002年采用缝牵引技术，使用记忆合金牵引器成功关闭了宽8mm长25mm的犬腭裂模型，并向后延长了腭骨，且未对上颌骨发育造成影响。陈刚等在2003年采用新设计的口内腭裂牵张装置成功关闭了宽5mm、长15mm的猫腭裂模型。阳金楚在2003年应用自制的腭部牵张装置成功延长了腭裂模型犬的腭部，证明了后退腭骨的可行性。张浚睿在2003年采用自行研制制作的牵张装置成功关闭了宽8mm、长30mm的犬人工腭裂模型。Carls等，Ascherman和Tibesar等分别采用切开牵引成骨的方法，单独实现了延长硬腭和关闭裂隙。至今仍无文献报道采用切开牵引成骨的方法，同时完成关闭裂隙及延长硬腭的牵张实验。本研究正是根据腭裂特点和功能性修复需要，从新的思路进行全新的设计。
　　
　　3．2　我们选择犬作为实验动物，主要考虑到犬硬腭骨后部宽阔、平坦，且骨质约有1mm左右的厚度，牵张器以螺钉固定后牢固且稳定性良好。两侧第四前磨牙腭侧有解剖稳定的腭大神经血管束，保证了手术中选择切口、翻瓣及形成骨转移盘时组织具有良好的血运。犬的口裂大，能处于很大的开口状态，清晰地暴露硬腭后部及软腭，使手术操作及后期牵张器加力、观察更加简便、易行。由于犬硬腭厚度小于3mm，而实验中形成的硬腭骨裂隙宽度达10mm，长度达25mm，已经超过了自身的愈合能力，加之手术将裂隙两侧的粘骨膜与鼻粘膜相对缝合，形成了软组织的屏障，使腭骨缺损区完全修复无法完成。另外很多相关研究。也都证明了犬腭裂模型的可靠性。为排除实验动物人造腭裂模型自行愈合的可能性，我们在实验中也设置了对照组。通过观察，在10周的实验期内，对照组犬硬腭骨缺损没有自行愈合，且有增大的趋势，说明实验中建立的犬腭裂动物模型的有效性。
　　截骨的方式和方向对牵张成骨的质和量有很大的影响。本实验中设计了“M”形截骨线，通过双侧纵形截骨，形成两个平行的骨转移盘，其移动的支抗由硬腭骨前部提供。由于是“M”形截骨线，在骨转移盘向近中移动的同时，实现了硬腭的后退，这样可以减少牵引的距离。骨转移盘在移动时牙槽骨及牙列不受应力作用，有效的避免了对牙弓和颌骨发育的影响。在截骨时要注意分离翼突与上颌结节的连接可以使翼突尾部与钩突、硬腭后部与软腭肌肉一起移动。
　　
　　3．3　牵张开始的时间对骨形成有影响，术后立即牵张，产生的间隙可能抑制成骨先驱细胞的增殖，同时也可能抑制损伤血管的修复，故许多学者都强调间歇期、牵张速率及频率对牵张成骨成功的重要性。间歇期实际上是骨折修复的早期阶段，骨外膜和骨内膜的成骨细胞参与修复，加上骨断端问有血供良好的肉芽组织，即便骨内血管切断了，有间歇期血循环也可在牵张前恢复。但是，获得最大成骨活性的理想间歇期尚不清楚，犬硬腭骨为板状的皮质骨且较薄，适当延长间隔期，可以在骨切开处形成血供良好的肉芽组织，且保证伤口的顺利愈合。在Carls的研究中发现犬硬腭切开后，18天后就形成了再次骨化，而无法牵张。因此推荐间歇期为10～12天，我们选择了12天的间歇期，研究发现可以成功成骨，而且没有骨转移盘的吸收和口鼻瘘的形成。本研究在牵张速率的选择上严格遵循IliZarov的张力拉力法则，每次硬腭后退0.4mm，近中移动0.2mm，频率2次/日。也就是说在缓慢稳定牵引力作用下，机体组织成为具有代谢活性的以增生和细胞生物合成功能被激活为特征的状态。这种再生过程与适当的血供和刺激作用的大小有关，这也是牵张成骨的生物学基础。在截骨中需要保护骨质的血供，以确保稳定的骨质形成，在长骨中可以采用骨皮质切开以保护骨髓的血供，此外也强调保护骨膜的重要性。而对于硬腭来说，其血供主要来源于腭大动脉和硬腭的粘骨膜和鼻腔侧粘膜。实验中我们发现将腭大动脉留在转运盘上往往很困难，大大增加了手术操作的难度。但是只要在截骨过程中保护鼻侧粘膜与骨片的附丽完好，就可以保证转运盘的血供。此外牵引力的稳定性也是能否生成新骨的决定条件，否则只能是纤维结缔组织和软骨的增生。在牵张器的设计中，增加了“L”形的固定臂和将移动杆设计为方形，以防止牵张过程中的牵张板的旋转和摆动，保证新骨的形成。
　　
　　3．4　对于外置型牵张器，最常见的并发症就是感染、松动和口鼻瘘的形成，导致牵张失败。在实验中我们发现牵张器固定螺钉穿粘膜处有局限性坏死现象，研究后表明这是由于局部压迫而导致的粘膜表层坏死并未向深层发展，牵张器拆除后一周左右可以自行愈合。为预防感染在手术中严格无菌操作，间歇期每天使用0.5％的碘伏进行硬腭冲洗，保持期每周冲洗两次，这样有效的避免了感染的发生。此外坚固内固定要足够牢靠，防止松动，严格按照牵张法则进行牵张，牵张后要有足够的保持期，可以有效防止口鼻瘘的形成。我们在实验中为使牵张器固定牢固，采用先按截骨线将骨截除一定的厚度，安装牵张器后轻轻晃动使转移盘与腭骨分离，故实验在手术操作上要求较高，有一定难度。
　　
　　3．5　骨牵张可以向后延长软腭组织，但是仍然没有相关的报道表明是否能够真正的对语言的改善有帮助，在本研究中犬的咽腔结构不能满足对腭咽闭合状态的观察研究，只是探讨了采用DO技术延长腭骨是完全可行的，在将来的临床实验中，可以将选择合适的实验对象进行鼻咽纤维镜和精确头影测量，来精确评价在牵张期硬腭，软腭和腭咽闭合的变化。此外犬硬腭形态与人类存在很大的差异，而人类的硬腭成拱形结构，牵张器的设计以及装置放置的位置和方向都需要进一步研究。