樱桃谷鸭粗脂肪需要研究进展_脂肪组织工程研究进展

　　成功构建组织工程化脂肪的关键在于：①种子细胞的选定和获取；②具有良好生物降解性和组织相容性的三维支架材料；③种子细胞增殖和分化的微环境。本文就这三方面的研究进展综述如下：
　　
　　1种子细胞的选定和获取
　　选择一种适宜的种子细胞是成功构建组织工程脂肪的前提。干细胞是一类未分化、保持多种分化潜能且长期生存的细胞群。干细胞按其分化阶段的不同，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两类。胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）具有多向分化潜能、长期未分化增殖能力和种系传递功能，但其来源不足、体外培养困难、定向诱导存在许多技术问题，用于临床存在免疫排斥、致瘤性和伦理学问题，故限制了临床应用[1]。成体干细胞来源丰富，取材方便，易实现自体取材，可克服宿主免疫排斥反应，故成体干细胞的研究很广泛[2]。成体干细胞的研究主要集中在间充质干细胞，它可来源于各种组织，包括：骨髓、脂肪、肝、脾、胰腺、睾丸、月经血、真皮、牙髓，甚至肺等[3]。其中主要代表是骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞。它们可通过冷冻、干燥、冷冻干燥等三种方法存储[4]。
　　1.1 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）:BMSCs是来源于骨髓间充质的成骨细胞的前体细胞，具有较强的自我增殖能力和多分化潜能，可分化骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肌腱细胞和神经细胞等[5-6]。它的表面标记分子已明确，并已用于细胞筛选及计数。分离、纯化骨髓间充质干细胞的方法有：全骨髓法、密度梯度离心法、免疫学分离法、贴壁筛选法、密度梯度离心与贴壁筛选相结合。现已证明密度梯度离心与贴壁筛选相结合，通过首次换液后频繁更换新鲜培养液和传代时缩短胰蛋白酶消化时间的方法，可得到纯度和分化能力均比对照组高的BMSCs细胞群。骨髓间充质干细胞是自骨髓移植供者骨髓获得，这种方法难免会给供者带来痛苦，同时还可能导致供区并发症。骨髓中的间充质干细胞含量极低，而且增殖与分化能力还受年龄的影响，年龄越大，其增殖分化能力也逐渐下降。这些因素限制了骨髓间充质干细胞的临床应用。
　　1.2 脂肪间充质干细胞(adipos-derived mesenchymal stem cells，ADSCs):前脂肪细胞是脂肪细胞的前体细胞，可向成熟脂肪细胞分化。前脂肪细胞因子1(Pref-1)是一种前脂肪细胞特殊标志的跨膜蛋白，该蛋白随着前脂肪细胞的分化而消失，因此前脂肪细胞因子1是前脂肪细胞的重要标记物[7]。前脂肪细胞的特点在于：能自发地分化成脂肪细胞，不会分化成软骨细胞和成骨细胞等。但是前脂肪细胞在体外传代培养几代后，就失去了分化能力，不能为脂肪工程生成足量脂肪细胞。脂肪间充质干细胞是一种存在于脂肪组织的间充质干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，可分化成成脂细胞、成骨细胞、软骨细胞、生肌细胞、内皮细胞[8]、肝细胞和神经细胞谱系。脂肪干细胞可以在任何白色脂肪组织中找到，包括皮下脂肪和网膜脂肪。通过脂肪抽吸术或脂肪切除术可获得大量的脂肪干细胞群。在脂肪组织中，每克组织含5000个间充质干细胞；常规脂肪抽取液300ml可获得在1×107和6×108之间不等的干细胞，并且90%以上的细胞具有活力，因此脂肪组织具有高密度的干细胞[9]。干细胞可通过胶原酶消化、反复过滤、离心而获得SVF，然后传代纯化。取材需考虑性别、年龄、取材位置，这些因素会影响细胞的内分泌功能，从而影响到干细胞的增殖和分化[10]。与BMSCs相比，ADSCs在成脂分化培养下生长更快，活力更强[11]；而且培养时出现衰老的时间更晚。目前ADSCs的特异性表面标记物尚不明确，只了解到脂肪间充质干细胞表达CD13、CD29、CD44、CD49e、CD54、CD55、CD63、CD73、CD90、CD105、CD144、CD146、CD166，它不表达CD11b、CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、STRO-1、CD3、CD117、CD62L、CD95L [12-13]。
　　1.3 脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchym al stem cells，hUCMSCs):hUCMSCs是存在于华氏胶中的一种具有自我更新、增殖和多向分化潜能的成纤维细胞样细胞。它与ADSCs、BMSCs和ESCs相比，具有以下优势：来源丰富，成本低，不涉及伦理问题，不会给捐献者带来伤害，表达胚胎干细胞某些特异标志等。hUCMSCs分离方法主要有：酶消化法、组织块贴壁法。在酶消化法中，由于脐带是富含葡萄糖胺和胶原的组织，故多用透明质酸酶和胶原酶消化以获得hUCMSCs[14]。hUCMSCs在体外被证实可向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、骨骼肌细胞、神经细胞、神经胶质细胞、多巴胺能神经细胞、内皮细胞、肝细胞、胰岛样细胞、平滑肌细胞、生殖细胞等方向分化。hUCMSC高表达CD73、CD90、CD105、CD54、CD13、CD29、CD44，不表达CD34、CD45、CD14、CD33、CD13。
　　
　　2支架材料
　　3T3-L1前脂肪细胞只有培养在三维环境下才能维持正常的细胞形态和功能，因此，寻找一个合适的生物支架材料是组织工程的关键。理想的支架材料需具备良好的生物相容性、良好的生物降解性、三维立体多孔结构及良好的细胞界面。目前已经有大量人工合成或天然来源材料被应用到脂肪组织工程中。合成支架的优点在于统一控制的条件下生产，可根据具体需要修改其化学和物理特性；天然材料的优点在于异物反应少。天然材料主要有：蚕丝、透明质酸、甲壳素、胶原和纤维蛋白等；人工合成的主要有：聚四氟乙烯、聚乙烯醉、聚乳酸（PLA）、聚乙酸醇（PGA）和聚乳酸-聚乙酸醇酸（PLGA）等。常用的主要有胶原支架、HYAFF11海绵支架(透明质酸衍生酯)、聚乳酸一聚乙醇酸共聚物支架等。
　　2.1 人工合成材料
　　2.1.1 PLGA:PGA和PLA具有可降解性、生物相容性、表面活动度，被广泛运用于支架材料。PLGA（PGA和PLA的复合物）具有促进种子细胞的粘附、增殖、分化的特性，近年来研究比较广泛。PLGA是通过孔隙间全连通的三维细胞支架，其自催化降解行为被明显抑制，支架的外观尺寸和孔隙率稳定，有利于获得外观尺寸稳定的工程化组织。但是，PLGA是通过水解酯键降解，降解产物乳酸和乙醇酸会降低周围微环境的pH值，从而影响组织和细胞的粘附与生长[15]。另外，该材料较硬，给患者带来不舒服，其来源主要靠进口，价格昂贵。这些因素在某种程度上限制PLGA在脂肪组织工程中的应用。近几年，研究人员通过溶剂蒸发技术在PLGA中加入三磷酸钠（TPP），不仅能降低pH，而且能促进干细胞在该支架上增殖，该技术将更促进PLGA的临床应用[15]。
　　2.1.2 HYAFF:透明质酸在组织工程领域占有很重要的地位。它存在于结缔组织、关节滑液和眼睛玻璃体中。在很多生物过程中起着重要作用，如组织水合作用、细胞分化、细胞行为和组织修复。HYAFF 是通过透明质酸和苯甲醇酯化形成的。HYAFF具有良好生物相容性、完全可降解性、水稳定性等特性，是一种很有潜力的支架材料，它可以加工生产出很多生物相容性好的材料，比如导管、膜、纱布、海绵等[16]。人肝细胞、皮肤成纤维细胞、角质细胞、软骨细胞、雪旺氏细胞、骨髓间充质干细胞和脂肪组织源性间充质干细胞已成功地在这些模型进行培养。海绵支架作为构建组织工程脂肪的支架，具有免疫原性较低，可促进细胞一支架复合物血管形成等优点，但其最大缺点则为它不利于前脂肪细胞的分化成熟，故也限制了其在脂肪组织工程研究中的应用。
　　2.2 天然来源材料
　　2.2.1 胶原：胶原不仅可以做组织支持物，而且是细胞外基质的重要组成成分，它表现很好的细胞亲合力。Itoi等[17]发现型胶原海绵与PLGA和透明质酸凝胶相比，它是最适合做脂肪组织工程的支架材料。但是由于它具有免疫原性、机械性能差、易于变形、花费高，所以难以独立构成三维支架。
　　2.2.2 蚕丝:蚕丝作为一个天然高分子，有较好的机械性能和良好的生物相容性[18]。蚕丝是由丝素蛋白（约75%以上）和丝胶蛋白（约25%）构成[19]。可通过化学和物理方法，去除丝胶蛋白成分，从而达到调整蚕丝的机械强度。丝素蛋白具有良好的生物相容性，手术缝合线可证明它的性能。3T3-L1前脂肪细胞能在蚕丝支架上很好地吸附，并表现出正常的形态和功能。刘毅等[20]研究发现，50 um为构建组织工程脂肪时蚕丝蛋白支架材料的最佳孔径。
　　2.3 微粒球:支架的形状决定了再生组织的应用，从而孕育了可注射微球的理念。前脂肪细胞和脂肪细胞以凝胶的形式注入，由于缺少足够的细胞粘附面积导致注入受限。针对以上原因，Burg等[21]发明了被水凝胶包裹的微粒球，可以被注入，脂肪细胞最终得到生长。动物实验模型中，微粒球和凝胶的联合适合脂肪组织再生，微粒球的不同构成会影响细胞粘附、基因表达、前脂肪细胞脂滴的形成。Masude等[22]利用含有丰富的血管和脂肪组织的网膜的碎裂组织包裹前脂肪细胞并植入小鼠体内，发现前脂肪细胞能在种植处产生脂肪组织。促进脂肪再生的另一种完全不同的方式是通过注入前脂肪细胞和细胞生长因子，促进前脂肪细胞迁移到靶目标后增殖再生脂肪组织。在小鼠基底膜注入前脂肪细胞和碱性成纤维细胞生长因子，注射部位的脂肪垫可观察到脂肪再生。这种再生脂肪很可能是前脂肪细胞和内皮细胞迁移造成的，该方法仍有待进一步的研究[23]。
　　
　　3微环境
　　细胞能在体内生长增殖，是由各种细胞因子和氧浓度调节完成的，因此两者均很重要。
　　3.1细胞因子:运用足量的生长因子可促进组织工程化脂肪的形成，应用生长因子的类型分体内与体外两种。体外培养中，应用一些生长因子是极有必要的，因为糖皮质激素、胰岛素、胰岛素增敏剂[24]、三异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、Asc-2-P、bFGF-2等生长因子能促进间充质干细胞分化。体内应用具有可选性，可能会加速组织工程化脂肪的形成。
　　组织工程化脂肪移植到受者体内，早期处于缺血状态，待新生血管形成后，才能建立血液循环。故研究在组织工程中加入与血管生成相关的生长因子，可以增强组织工程化脂肪的血管化，加速血液循环的建立，减少脂肪细胞的坏死和吸收。这些因子主要有：血小板衍生生长因子（PDGF）、血管生成素-1（Ang-1）、转化生长因子-β（TGF-β）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）等。VEGF 和Ang-1分别对血管生成的不同时期起作用，并且形成的血管紊乱，不稳定[25]。VEGF 和胰岛素样生长因子-1共同作用能形成比较稳定的血管结构[26]；PDGF、TGF-β和Ang-1均起稳定血管的重要作用。纯化的血管生成相关因子因体内半衰期短，不能起到理想效果，通过转基因技术，可使他们有效而持续地表达。但如果不严格控制每个细胞周围的微环境，就有可能诱导异常血管及血管瘤的产生。为了使该技术得到临床运用，研究人员发明了一种以流式细胞分流仪为基础的高通量方法来确定转基因在转基因细胞的表达水平，从而快速去除异常细胞，纯化正常表达的细胞[27]。该技术成功地使转有VEGF的成肌细胞在体内骨骼肌里形成丰富的血管网，避免异常血管的产生。细胞和基因治疗相结合法为组织工程的高效植入提供了一个新的思路。Lin等[28]成功转导Pdx1基因到ADSC，得到稳定产生胰岛素的细胞。研究表明：转染VEGF165基因的ASCs能够大量、稳定且持续较长时间分泌VEGF,能为血管形成提供丰富稳定的血管生成因子，有促进工程化脂肪组织的血管化的作用,具有向内皮细胞分化的潜能,参与血管形成,使得内皮细胞需要的数量相对减少,脂肪组织工程在临床上应用的可能性增加。
　　3.2氧分压:研究人员30年前就开始研究造血系统中氧分压对干细胞的生理影响。实验研究中体外进行细胞培养的氧浓度大多数在20%左右，然而天然的内环境细胞的氧浓度往往要低很多：如动脉平均氧分压为12%[29]。检验一位志愿者的骨髓抽取液时，发现样本处于低氧状态，浓度大约在1%～2%[30]。尽管脂肪组织血管丰富，但是在小鼠体内的脂肪细胞氧浓度只有3%左右[31]。故成人脂肪干细胞同样处于低浓度氧状态。最直接的证据可以来源于造血干细胞，它与骨髓间充质干细胞处于同一微环境当中[32]。有研究表明：低浓度氧的骨髓间充质增殖数目是正常氧浓度的30倍[33]；胚胎干细胞能在低氧下保持未分化状态长达4周，保持其全能性长达18个月[34]；骨髓间充质干细胞在氧浓度2%培养下，持续表达胚胎干细胞标志OCT-4长达6周[35]。所以，低浓度氧可以增强多种干细胞及祖细胞的增殖能力，同时抑制分化，维持其多能性。Valorani等[36]研究发现鼠的脂肪间充质干细胞在低氧下培养，Sca-1/CD44表达增加，增殖数量增加，分化潜能被抑制，转移到正常氧浓度培养，成脂分化能力明显增强。亦有研究表明低氧浓度对分化成其他特定的细胞株有积极作用，尤其是软骨细胞和心肌细胞[37]。Fink等[38]认为1%氧浓度能诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，无脂肪特定的基因表达增加；然而Lee等[39]认为2%氧浓度能抑制脂肪干细胞的成脂分化。促进干细胞分化与保持其多能性的最适宜氧浓度至今尚未知。低氧还可通过调节干细胞向内皮细胞的分化和生长因子分泌水平，从而影响工程化脂肪的血管化。在低氧的刺激下，成人脂肪间充质干细胞分泌的VEGF增加5倍[40]。一些体外研究也证明了骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞在低氧期间均有VEGF表达的上调。
　　
　　4脂肪组织工程的临床应用和展望
　　研究者们不断采取多种有效方法使脂肪组织工程有了很大发展,如建立3D支架结构，各种支架材料最适孔径，转导血管生长因子,制造血管类似物,寻求和制造新的生物聚合物材料，动态培养及不断更换培养基等。要让组织工程化的脂肪组织更好地应用于临床，需移植物有很好的血管化，才能保证形态和功能的维持。细胞归巢技术可诱导相关干细胞向特定的生理解剖位置转移，增殖和分化脂肪组织，弥补坏死吸收的损失。随着科学的发展，各种知识的升华，必将把上述问题予以解决，相信组织工程化脂肪最终将广泛应用于临床，为软组织修复带来更好的明天。
　　
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　　[收稿日期]2011-04-20 [修回日期]2011-05-31
　　编辑/李阳利