凝血酶对人皮肤成纤维细胞增殖作用的研究 成纤维细胞名词解释

　　[摘要]目的：观察不同浓度的凝血酶对成纤维细胞的刺激作用，以及阿加曲班对这种刺激的抑制作用。方法：采用贴壁法进行人皮肤成纤维细胞原代培养，并传代、鉴定。用MTT法检测不同浓度凝血酶刺激后的成纤维细胞活力。用氯胺T法检测不同浓度凝血酶刺激后的细胞上清中羟脯氨酸含量。用免疫组化的方法检测凝血酶刺激后的成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况。在培养液中加入阿加曲班后重复上述检测。结果：①培养的细胞为典型的成纤维细胞形态，波形蛋白单克隆抗体免疫组化染色呈阳性；②加入不同浓度凝血酶的各组吸光值均高于不加凝血酶组（A组）（P＜0.01），加入阿加曲班和凝血酶的各组吸光值与A组无显著性差异（P＞0.05）；③加入不同浓度凝血酶的各组细胞上清中羟脯氨酸含量均高于不加凝血酶组（A组）（P＜0.01），加入阿加曲班和凝血酶的各组上清中羟脯氨酸含量与A组相比无统计学差异（P＞0.05）；④凝血酶刺激后的成纤维细胞中有α-SMA的表达，加入阿加曲班后此种表达被抑制。结论：凝血酶能诱导成纤维细胞增殖、胶原分泌量增加，能刺激成纤维细胞表达α-SMA，使成纤维细胞转变为肌成纤维细胞。阿加曲班能抑制凝血酶的这种作用。
　　[关键词]凝血酶；成纤维细胞；阿加曲班
　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）03-0434-05
　　
　　Study of thrombin on proliferation of fibroblasts isolated from mini pig"s skin
　　XIE Xiang1,ZHUANG Hong-xing2,LI Dong3
　　(1.Shangdi Outpatient of the Third Hospital of Beijing University,Beijing 100084,China;2.Auricular Reconstructive Center ofPlastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical Collage, Beijing 100144,China;3.Department of Plastic Surgery,The Third Hospital of Beijing University,Beijing 100191,China）
　　
　　Abstract:ObjectiveObserve the stimulatory functions of thrombin different concentration on fibroblasts, and the inhibitory actions of argatroban on the stimulatory functions.MethodsThe minipig skin fibroblasts were cultured in monolayer. The vigor of fibroblasts which were stimulated by different concentration of thrombin was detected by MTT. The contents of hydroxyproline in supernatant were detected by chloramines T method. The expressions of α-SMA in fibroblasts which were stimulated by thrombin, were detected by immunohistochemistry staining. After argatroban was infused into the culture solution, the detections mentioned above were repeated.Results① The cells appeared to be the typical fibroblast, the immunohistochemistry staining of α-SMA in the cells were positive. ②Compared with the group without thrombin, the OD value of the groups contained different concentration of thrombin were increased(P�0.01), the OD value of the groups contained different concentration of thrombin and argatroban had no changes(P�0.05).③Compared with the group without thrombin, the hydroxyproline content in supernatant of the groups contained different concentration of thrombin were increased(P＜0.01), the hydroxyproline content in supernatant of the groups contained different concentration of thrombin and argatroban had no changes (P＞0.05). ④α-SMA expressed in the fibroblast stimulated by thrombin. The expression of α-SMA was inhibited by argatroban.ConclusionsThrombin can induce fibroblast"s proliferation, make fibroblast product more collagen,increase the expression of α-SMA in fibroblast,transform fibroblast to myofibroblast. Argatroban can inhibit these effects of thrombin.
　　Key words:thrombin;fibroblasts;argatroban
　　
　　有研究表明血肿能造成扩张器外包膜增厚和乳房假体纤维包膜挛缩[1-2]。纤维包膜中的主要细胞是成纤维细胞，成纤维细胞分泌的胶原蛋白是纤维包膜的主要成分。这说明血肿中的某种成分可以刺激成纤维细胞增殖，使胶原分泌增加，并使包膜挛缩。有研究表明[3-5]凝血酶是成纤维细胞的促有丝分裂剂和化学引诱物，能使成纤维细胞的前胶原生成增加。本实验用不同浓度的凝血酶刺激体外培养的人皮肤成纤维细胞，观察成纤维细胞在凝血酶的作用下，细胞活力及其胶原合成能力的变化，并通过免疫组化染色观察细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actinα-SMA）的表达情况。
　　1材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1实验标本：标本取自整形外科患者手术中修剪掉的正常皮肤。
　　1.1.2 主要实验试剂：胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS，杭州四季青），DMEM（H）培养液（Hyclone），0.25%胰蛋白酶（Gibco BRL），青霉素－链霉素溶液（Hyclone），PBS缓冲液（Hyclone），羟脯氨酸(瑞士Fluka公司)，氯胺T(上海化学试剂公司)，二甲氨基苯甲醛(天津化学试剂研究所)，高氯酸(天津市东方化工厂)，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 （北京天来生物医学科技有限公司），波形蛋白单克隆抗体（上海肯强仪器有限公司），SP法免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物公司），α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（武汉博士德生物公司），凝血酶(Sigma公司)，阿加曲班（日本三菱制药株式会社）。
　　1.1.3主要实验设备：超净工作台（北京碧都空气净化设备公司），22560酶标仪（Biotrak，Austria），Soruau T21 高速冷冻离心机（Kendro，USA），3111细胞培养箱（Thermo Forma，USA），OLYMPUS TH4-200 倒置显微镜（OLYMPUS，Japan），Ultrospec 3300pro分光光度计（Biochrom，England）。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1人皮肤成纤维细胞的分离、培养
　　1.2.1.1人皮肤的取材：在无菌条件下将所取的正常人皮肤立即置入无血清的DMEM培养液中。
　　1.2.1.2人皮肤成纤维细胞的培养：在超净工作台内将皮肤置于培养皿中，常规处理后，放在 37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱，4h后将培养瓶缓慢放平，静止培养。7天后在倒置相差显微镜下观察，有成纤维细胞游离出，并进行传代培养。
　　1.2.2 成纤维细胞的鉴定
　　1.2.2.1 形态学：用Olympus倒置显微镜观察成纤维细胞的形态。
　　1.2.2.2 波形蛋白免疫组化：①细胞固定：取第二代生长状态良好的成纤维细胞，用0.25%胰酶消化后接种于置有盖玻片的6孔板中，待细胞爬满后取出玻片，0.01M PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，0.01M PBS清洗5min×4次；②染色方法：按照北京中杉金桥生物技术有限公司产品SP-9000试剂盒提供的方法进行操作。鼠抗人波形蛋白单克隆抗体的工作液浓度为1:50。
　　1.2.3 MTT法检测成纤维细胞活性：取对数生长期的成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，调整浓度为3×104/ml，接种于96孔板内，0.1ml/孔。置培养箱内孵育24h，待细胞完全贴壁后更换为含凝血酶(凝血酶粉剂溶解于生理盐水中，-20℃贮存，浓度为1 000U/ml)和阿加曲班（1mg/ml）的培养液。共设9个组，分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I组，每组设10个复孔：A组加入单纯培养液，不加入凝血酶和阿加曲班；B、C、D、E组加入培养液的凝血酶终浓度分别为0.5U/ml、1U/ml、5U/ml、10U/ml；F组加入的培养液含阿加曲班10μg/ml；G、H、I组加入的培养液中，凝血酶终浓度分别为1U/ml、5U/ml、10U/ml，阿加曲班终浓度分别为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。置培养箱中孵育72h后，每孔加入10μl MTT(5mg/ml)继续孵育4h，细胞内会产生深紫色的结晶，之后每孔加入100μl溶解液，孵育3～4h，直至镜下观察见深紫色结晶完全溶解。用酶标仪检测570nm吸光度，吸光度值的大小反映成纤维细胞成活数量及活性。
　　1.2.4氯胺T法测上清中羟脯氨酸的含量[6]：取对数生长期的成纤维细胞，以0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液调整细胞浓度为3×104个/ml，按5ml/瓶接种于25cm2培养瓶内，24h后待细胞贴壁后，换成含有凝血酶和阿加曲班的培养液。共设9个组，分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I组：A组加入单纯培养液，不加入凝血酶和阿加曲班；B、C、D、E组加入培养液的凝血酶终浓度分别为0.5U/ml、1U/ml、5U/ml、10U/ml；F组加入的培养液含阿加曲班10μg/ml；G、H、I组加入的培养液中，凝血酶终浓度分别为1U/ml、5U/ml、10U/ml，阿加曲班终浓度分别为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。继续培养72h。以0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液调整各组细胞浓度为1×104个/ml，按1ml/孔接种于24孔板，每组设8个复孔，8h后待细胞贴壁后换液，继续培养72h。取上清液进行检测。
　　取无细胞培养液作为空白组，排除外源性羟脯氨酸影响。检测时将上清1ml加入有盖试管中，加浓盐酸1.2ml，110℃烘箱中水解2h，加40%氢氧化钠1.2ml，加水稀释至10ml，以1N盐酸及1N氢氧化钠调pH值至6.0，3 000 r/min离心10min，取上清液1ml，加水1ml、0.05mol/L氯胺T 1ml混匀。25℃水浴，充分振荡2次，加1ml过氯酸，混匀，置5min，加10%二甲氨基苯甲醛1ml，混匀，100℃水浴2 min，冰水冷却。用PU8800型分光光度计，在560 nm处比色，读D值。以羟脯氨酸(HPr)标准液作标准曲线，得出样品中羟脯氨酸的含量。
　　1.2.5 α-SMA抗体免疫组化染色：取对数生长期的成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，调整浓度为3×104/ml，接种于25cm2培养瓶中，每瓶5ml。置培养箱内孵育24h，待细胞完全贴壁后更换培养液，分为4组：A组培养液中不加凝血酶，孵育72h；B组培养液中凝血酶浓度1U/ml，孵育24h；C组培养液中凝血酶浓度1U/ml，孵育72h；D组培养液中凝血酶浓度1U/ml，阿加曲班浓度为1μg/ml，孵育72h。
　　1.2.6 细胞固定：成纤维细胞用0.25%胰酶消化后接种于置有盖玻片的6孔板中，待细胞爬满后取出玻片，0.01M PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，0.01M PBS清洗5min×4次。免疫组化染色方法同上，一抗为1:100的α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体。
　　
　　2结果
　　2.1人皮肤成纤维细胞形态学观察及鉴定
　　2.1.1倒置显微镜下观察细胞呈长梭形，为典型的成纤维细胞形态，细胞大致呈平行排列，核较大，胞质较多。
　　2.1.2 人皮肤成纤维细胞波形蛋白单克隆抗体免疫组化染色结果，细胞呈阳性反应（见图1）。
　　2.2MTT法检测结果：加入不同浓度凝血酶的各组（B、C、D、E组）吸光值均高于不加凝血酶组（A组）（P�0.01），其中凝血酶浓度为1U/ml（C组）的吸光值最高，与其他组相比有显著差异（P�0.01）。加入阿加曲班10μg/ml（F组）的吸光值与A组相比无统计学差异（P�0.05）。加入不同浓度的凝血酶和阿加曲班的各组（G、H、I组）吸光值组间无差异，与A组相比较无统计学差异（P�0.05）（见表1）。
　　2.3 氯胺T法测上清中羟脯氨酸含量结果：加入不同浓度的凝血酶的各组（B、C、D、E组）的上清中羟脯氨酸含量均高于不加凝血酶组（A组）（P�0.01），其中凝血酶浓度为1U/ml和5U/ml（C组和D组）的羟脯氨酸含量最高，与其他组相比较有显著差异（P�0.05）。加入阿加曲班10μg/ml（F组）的羟脯氨酸含量与A组相比无统计学差异（P�0.05）。加入不同浓度的凝血酶和阿加曲班的各组（G、H、I组）羟脯氨酸含量与A组相比无统计学差异（P�0.05）（见表2）。
　　2.4 α-SMA抗体免疫组化染色结果：（见图2）。
　　
　　3讨论
　　3.1 关于凝血酶的作用：凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，除了在血液凝固过程中起关键作用外，在组织修复和伤口愈合过程中也有很重要的作用。凝血酶是成纤维细胞的促有丝分裂剂和化学引诱物[3-5]。有学者证明浓度为1nM以上的凝血酶能刺激人胎儿肺成纤维细胞的前胶原生成增加，浓度为10nM的凝血酶能使前胶原生成增加60%～117%，并证明凝血酶的这种作用是通过PAR-1的蛋白水解激活而实现的[7]。Hewitso等用凝血酶刺激大鼠的肾间质成纤维细胞发现，0.1U/ml和0.5U/ml的凝血酶分别使培养的细胞数较对照组增多66%±41%和47%±41%，0.5U/ml的凝血酶使细胞的I型前胶原增多2.4倍[8]。
　　3.2 关于MTT和羟脯氨酸含量的检测
　　3.2.1 本实验用不同浓度的凝血酶刺激人皮肤成纤维细胞，观察成纤维细胞活力、数量和胶原分泌能力的变化，并应用一种高活性的凝血酶抑制剂－阿加曲班，对凝血酶的作用进行干预，观察阿加曲班抑制凝血酶的效果，并观察阿加曲班对成纤维细胞的作用。
　　3.2.2 关于凝血酶在体外细胞培养实验的用量问题，国内外文献报道了0.1～40U/ml不等的用量。我们在实验中选用浓度为0.5U/ml、1U/ml、5U/ml、10U/ml的凝血酶。阿加曲班是一种直接型凝血酶抑制剂，能快速、选择性、可逆性的阻断凝血酶的催化位点及非极性区，从而抑制凝血酶的作用。阿加曲班对凝血酶具有高度亲和性，有研究表明[9]，阿加曲班阻断50%游离凝血酶的浓度为1.1μmo1/L。根据这种换算方式，1ml液体中加入0.57μg的阿加曲班即可达到1.1μmo1/L的浓度，为了达到完全抑制凝血酶的效果，我们应用1μg/ml的阿加曲班来抑制1U/ml的凝血酶。
　　3.2.3 本实验采用MTT法检测细胞的数量和活力。实验结果表明，加入不同浓度凝血酶的各组（B、C、D、E组）吸光值均高于不加凝血酶组（A组），其中凝血酶浓度为1U/ml（C组）的吸光值最高，与其他组相比有显著差异。这说明凝血酶具有刺激成纤维细胞增殖的能力，当浓度为1U/ml时凝血酶的这种能力最强。加入不同浓度的凝血酶和阿加曲班的各组（G、H、I组）吸光值组间无差异，与A组相比无统计学差异。这一结果表明培养液中加入凝血酶抑制剂阿加曲班后，凝血酶的作用被抑制，失去了刺激细胞增殖的功能。单纯加入阿加曲班10μg/ml（F组）的吸光值与A组相比无统计学差异，表明阿加曲班对人皮肤成纤维细胞既无刺激增殖的作用，也没有抑制作用。
　　3.2.4 羟脯氨酸是合成胶原的特有材料，在胶原中的含量较为稳定，因此在临床和实验中，胶原总量的测定常采用羟脯氨酸法，间接反映总胶原蛋白含量[10]。我们应用氯胺T法检测培养液上清中羟脯氨酸含量，以检测成纤维细胞分泌胶原蛋白的能力。本实验的设计是先以不同浓度的凝血酶刺激细胞，然后再取数量相等的细胞在不含凝血酶的培养液中培养72h后，检测上清中的羟脯氨酸含量，这样可以排除凝血酶刺激细胞增殖的影响，检测受到不同浓度凝血酶刺激后的数量相同的细胞胶原蛋白分泌量。实验结果表明使用不同浓度凝血酶的各组（B、C、D、E组）上清中羟脯氨酸含量均高于不加凝血酶组（A组），其中凝血酶浓度为1U/ml和5U/ml（C组和D组）的羟脯氨酸含量最高，与其他组相比有显著差异。这一结果表明凝血酶刺激后的成纤维细胞，在没有凝血酶的环境中仍有较高的胶原分泌量。含有不同浓度凝血酶和阿加曲班的各组（G、H、I组）羟脯氨酸含量与A组相比无统计学差异。这说明阿加曲班抑制了凝血酶的作用，使凝血酶失去了刺激细胞增加胶原分泌的能力。含有阿加曲班10μg/ml的F组羟脯氨酸含量与A组相比无统计学差异，这显示阿加曲班对成纤维细胞的胶原分泌无明显作用。
　　3.3 关于凝血酶刺激α-SMA的表达：在很多关于纤维变性病变的文献中，把表达α-SMA的成纤维细胞称为肌成纤维细胞(myofibroblast, MF)[11-13]。MF胞胞浆内含有大量的微丝，具有平滑肌细胞的收缩能力，是创面收缩的动力细胞[14]。扩张器周围的纤维囊壁中含有大量的MF，MF的收缩活性不仅会使组织扩张的进程减慢，而且还会使扩张后的组织回缩率增高，影响实际的扩张面积和手术应达到的预期效果。体外培养也证实[15]，成纤维细胞可以受刺激分化，获得表达α- SMA的能力而成为MF。关于凝血酶是否能刺激成纤维细胞使其表达α-SMA，尚存在争议。Galina S Bogatkevich等[16]的研究表明凝血酶刺激正常肺成纤维细胞表达α-SMA，变为肌成纤维细胞表型，并证明凝血酶的这种作用是通过蛋白激酶C信号转导途径实现的。而Hewitso用凝血酶刺激大鼠的肾间质成纤维细胞没有发现细胞中α-SMA表达的变化[8]。本研究用1U/ml的凝血酶刺激成纤维细胞，应用免疫组化的方法证明受到凝血酶刺激的细胞胞浆内有α-SMA的表达，而且这种表达是随刺激时间延长而增强的。加入阿加曲班的D组细胞内只有极弱的α-SMA表达，这说明阿加曲班抑制了凝血酶的作用，抑制了α-SMA的表达。
　　本实验证实了体外培养的人皮肤成纤维细胞受到一定浓度凝血酶刺激后，胶原分泌量增加，细胞浆内有平滑肌肌动蛋白表达。在体内，血肿形成后会产生大量凝血酶，血液凝固时产生的一些与纤维蛋白结合的凝血酶可持续存在于血肿内，并可缓慢释放到周围的组织中[17]。依据本实验结果，我们可以推论这些血肿形成后被释放出的凝血酶会持续刺激血肿周围组织的成纤维细胞增殖，产生大量胶原蛋白，并使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。本实验的结果可作为进一步研究血肿对皮瓣毒性作用的基础。
　　
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　　[收稿日期]2010-10-20 [修回日期]2011-02-14
　　编辑/张惠娟