猪O型口蹄疫型基因工程疫苗毒株构建论文33514分析报告

　 目 录

　摘 要 III

　关键词 III

　Abstract III

　Key words III

　英文缩略词表 IV

　1前言 1

　1.1口蹄疫的基本特征 1

　1.1.1口蹄疫病毒基本概念 1

　1.1.2口蹄疫病毒生物学特征 1

　1.1.3口蹄疫病毒危害 1

　1.2泛素蛋白及其对抗原的影响 2

　1.3 siRNA干扰机制 3

　1.4 γ干扰素与口蹄疫免疫 4

　1.5 FMD疫苗研究进展 5

　1.6本实验研究的目的与意义 6

　2实验材料 6

　2.1菌种、毒株、载体与质粒 6

　2.2主要药品与试剂 6

　2.3主要培养基及配制 7

　2.4缓冲液及其配制 7

　2.5其他溶液 7

　2.5空斑筛选与纯化相关试剂 8

　2.6寡核苷酸引物 8

　3实验方法 8

　3.1转移载体PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建策略 8

　3.1.1限制性内切酶酶切反应 9

　3.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测 9

　3.1.3酶切产物的回收 9

　3.1.4回收产物的去磷酸化反应 9

　3.1.5目的基因与载体的酶连反应 9

　3.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化 10

　3.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） 10

　3.2.2质粒的转化 10

　3.2.3质粒的小量制备（OMEGA试剂盒） 10

　3.2.4质粒的大量制备（OMEGA试剂盒） 11

　3.2.5阳性质粒的酶切鉴定 11

　3.3以PRV为载体表达FMDV抗原蛋白基因P1，泛素蛋白与抗原P1的融合基因Ubi- P1，RNA干扰基因shRNA，干扰素基因IFN-γ的重组病毒的构建 12

　3.3.1细胞的培养、冻存与复苏 12

　3.3.2 PRV TK-/gE-/LacZ+基因组DNA的提取 12

　3.3.3脂质体介导的共转染 13

　3.3.4重组病毒空斑纯化和PCR鉴定 13

　3.3.5鉴定用PCR模板处理 14

　3.3.6重组病毒PCR鉴定 14

　4结果与分析 15

　4.1转移质粒PIECMVUbiP1的构建 15

　4.2转移质粒PIECMVUbiP1P1的构建 15

　4.3转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建 16

　4.4共转染产物接毒第三代PCR鉴定 17

　4.5重组病毒的空斑纯化及PCR鉴定 18

　4.5.1空斑的形成 18

　4.5.2在PK-15细胞上的第一轮空斑筛选 19

　4.5.3在Vero细胞上的第一轮空斑筛选 20

　4.5.4 重组病毒的空斑筛选结果 20

　5讨论 20

　5.1 载体的构建 20

　5.2 细胞的传代培养 21

　5.3 空斑筛选实验 21

　5.3.1 空斑筛选细胞的选择 21

　5.3.2 RNA干扰对空斑筛选结果的影响 22

　5.3.3干扰素γ对空斑筛选结果的影响 22

　参考文献： 22

　致 谢 24

　猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建

　The construction of recombinat Virus for Generating a Novel Genetic Engineering Vaccine Agansit O Type FMDV of Pig

　摘 要

　口蹄疫是一种急性、高度传染性的病毒性传染病，虽自20世纪初口蹄疫疫苗已经在世界部分地区应用，但目前全球口蹄疫疫情依然严重，也构成了世界动物及动物产品贸易的障碍。由本实验室构建的猪伪狂犬病毒基因缺失株PRV TK-/gE-/LacZ+作为一种病毒载体，具有安全性好、容量大、重组效率高等优点，本研究用人工合成的O型口蹄疫P1基因作为抗原基因，用和泛素（Ub）融合的UbiP1作为另一个抗原基因同时达到增强细胞免疫效果，再将针对口蹄疫3B基因设计的shRNA和具有抗病毒及免疫调节效果的猪IFN-γ与以上两个功能基因串联，构建了具有四个功能基因的转移载体，将此转移载体和PRV缺失株TK-/gE-/LacZ+共转染细胞，发生基因重组后进行了空斑纯化，经鉴定，初步得到了含有P1基因、UbiP1、shRNA、IFN-γ四个功能基因的重组伪狂犬病毒，为进一步构建新型基因工程疫苗打下基础。

　关键词：抗原基因；泛素蛋白基因；干扰素基因；重组病毒

　Abstract

　Foot and mouth disease (FMD) is an acute, highly contagious virul infection disease. Although vaccines, available since the early 1900s, have been used in parts of the world, the disease still is a serious globe outbtreak and become sanitary barrier to the commerce of animals and animal products. The vector virus PRV TK-/gE-/LacZ+ , constructed by our laboratory , has the advantages of safety, high capacity, high restructuring efficiency. 朗读显示对应的拉丁字符的拼音This study selecte synthetic O type FMDV P1 gene as antigen gene, P1 and ubiquitin (Ub) fusion gene UbiP1 as another antigen gene to enhance cellular immune effect. Then use shRNA designed for 3B gene of FMD, IFN-γ gene of porcine has anti-viral and immunomodulatory effects tandem with the above two function gene, constructed transfer vector with four functional gene. Making the transfer vector and the PRVTK-/gE-/LacZ+ cotransfected in cells. After the occurrence of recombinant, plaques were purified, identified, initially received recombinant pseudorabies virus with four functional genes of P1 gene, UbiP1, shRNA and IFN-γ, in order to further build a new foundation for the construction of genetic engineering vaccine.

　Key words：antigen gene; ubiquitin; nterferon gene; recombinant virus

　英文缩略词表

　Abbreviation

　缩写 英文名称 中文名称 FMD

　FMDV

　Ub

　UPS

　RNAi

　siRNA

　shRNA

　SIF

　IFNγ

　PRV

　NCS

　Amp

　DMEM

　LB

　PBS

　PCR

　SDS

　EB

　OD

　EDTA

　PK

　Vero

　DMSO

　MEM Foot-and-month disease

　Foot-and-Mouth disease virus

　Ubiquitin

　Ubiquitin-proteasome system

　RNA interference

　RNA interference gene

　RNA interference gene

　Interference gene fragment

　γ-interferon gene

　Pseudorabies virus

　Newborn calf serum

　Amplicillum

　Dulbecco's Modified Eagle Medium

　Luria-Bertani medium

　Phosphate buffer solution

　Polymerase chain reaction

　Sodium dodecylsulphate

　Ethidium bromide

　Optical density

　EDTA Disodium Salt

　Pig kidney cells

　African green monkey kidney cells

　Dimethyl sulfoxide

　Minimal Essential Medium 口蹄疫

　口蹄疫病毒

　泛素

　泛素蛋白酶系统

　小RNA干扰

　小RNA干扰基因

　小RNA干扰基因

　干扰基因区段

　γ干扰素基因

　伪狂犬病病毒

　新生牛血清

　氨苄青霉素

　改良Eagle培养基十二烷基磺酸钠溴化乙锭乙二胺四乙酸Foot and Mouth Disease Virus, FMDV）感染引起的人畜共患的急性、烈性传染病，该病全世界分布广泛，主要感染偶蹄类，一旦爆发常造成巨大的经济损失。由于存在制作灭活苗灭活不彻底和毒力返强造成的潜在危险，开发新型基因工程疫苗已引起人们的重视。

　1.1.2口蹄疫病毒生物学特征

　口蹄疫病毒呈球形，正二十面体结构，直径20-25nm;无囊膜，对酸碱敏感，口蹄疫病毒粒子由衣壳和病毒核酸构成，衣壳由60个不对称的亚单位组成，每个亚单位含一分子的VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP4位于病毒颗粒内部。FMDV属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，有7个血清型，即O，A，C，SAT 1, SAT 2, SAT 3和AsiaⅠ型(Rodriguez and Grubman, 2009)，各个血清型间无交叉反应（陆承平等，2005），病毒的这种特性，给其检疫、防疫带来极大的困难。

　FMDV基因组为具有感染性的单股正链RNA，大小约8.5kb，只有一个开放的读码框(open reading frame, ORF)，两侧各有一个非编码区(non coding region, NCR)。开放读码框首先翻译为一个多聚蛋白，经过蛋白酶切割为成熟的结构和非结构蛋白以及一些中间体。FMDV基因组P1区编码结构蛋白，P12A前体物在3C蛋白酶作用下形成由VP4-VP2，VP3和VP1组成的原体。5个原体组成一个五聚体，十二个五聚体组装成包含RNA的前病毒粒子或者缺乏RNA的空衣壳。在感染细胞中，FMDV 3C蛋白酶基因编码的蛋白能催化加工P12A前体衣壳蛋白为VP0、VP1、VP3，这三种蛋白能相互作用形成5S原体，成为病毒粒子结构的组件，形成病毒样颗粒，这种没有病毒核酸的病毒样颗粒具有与全病毒相同的免疫原性。

　1.1.3口蹄疫病毒危害

　FMDV主要感染偶蹄类物种如猪牛绵羊山羊水牛许多野生偶蹄类物种可能受到感染，骆驼被证明(Larska et al, 2009)。一旦暴发，能迅速演变为生物灾害，直接受到重大甚至于毁灭性打击的是畜牧业相关产业大批动物扑杀销毁，引发严重的公共卫生问题，造成社会的恐慌破坏力还波及其它行业，对外出口被迫关闭，疫区被严密封锁，旅游受阻根据口蹄疫的危害程度，世界动物卫生组织将口蹄疫列为A类动物传染病我国农业部将口蹄疫列为一类动物疫病，将口蹄疫病毒列为一类动物病原微生物。Smalle and Vierstra, 2004）

　Fig.1:Schematic of the ubiquitin-proteasome system

　泛素(Ubiquitin, Ub)是一个由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链，泛素化过程是一个复杂的，并受到高度调控的过程，由三个级联反应组成，需要三类酶参与催化。这三类酶分别被称为E1—泛素激活酶，E2一泛素耦联酶，E3一泛素连接酶。整个过程大致如下：首先在ATP的参与下，在E1的半胱氨酸活性位点与泛素C末端的甘氨酸形成硫酯键(Ciechanover et al., 1981; Hershko et al., 1981)；接着，连接在E1的泛素被转移到E2的活化半胱氨酸位点；最后，在E3的催化下，泛素C末端与底物的某个位点的赖氨酸结合(Ciechanover, 1993; Weissman, 2001)。当第一个泛素分子连接到靶蛋白上后,另外一些泛素分子在E3 的催化下相继与底物相连的泛素分子的第46位赖氨酸残基相连,形成一条多聚泛素链，作为底物被蛋白酶体识别和降解的靶向性信号(Ii Ito et al., 1997)，一旦靶蛋白被4个以上的泛素分子修饰,它们就被蛋白酶体降解。完成泛素化的蛋白质结构被展平进入26S蛋白酶体，经过它的处理，蛋白质就被切成由7至9个氨基酸组成的短链，泛素分子可被水解下来,重复利用(Groll et al., 1997; Davies 2001; Smalle and Vierstra, 2004)。泛素系统广泛参与了多种基本的细胞过程并由此引起了特别的关注(Huang et al., 1995)，其中泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway)是一个新近受到关注的调节蛋白质降解与功能的重要系统(Pickart and Eddins, 2004)。这是真核细胞内除溶酶体外的另一种非常重要的蛋白降解系统，也是调节各种细胞生物学过程的重要机制，为人们提供了一个增强抗病毒效果的新思路。

　1.3 siRNA干扰机制

　图2：RNA干扰现象的机理（）

　Fig.2: The mechanism of RNA interference

　(Fire et al., 1998; Sharp, 2001; Hannon, 2002; McManus, 2004)，转录受抑制或翻译受到抑制，从而在转录水平或转录后水平干扰基因表达1998年Fire等首次把双链RNA(dsRNA)注射入一种线虫（caenorhabditiselegans） 体内，dsRNA使互补的mRNA降解，诱导了靶向性的基因表达沉默(genesilencing),这一现象称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。同植物中的共抑制(co suppression)或转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS）、真菌中的基因表达压抑（quelling）一样，RNAi也是一种典型的转录后基因表达调控方式，是美国《Science》和《Nature》评出的2002年度最重要的科技成果之一，成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。康奈尔大学的Guo等利用反义RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中的par1基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA(sense RNA)相反的结果，但最终的结果却令他们费解:二者同样阻断了par1基因的表达途径。直到1998年，Fire等的研究结果证明，在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA，这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的，这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNAi。随后的研究结果发现，RNAi现象(McManus, 2004)。生物体可利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用RNAi属于转录后基因沉默机制，其本质是siRNA高效、特异地阻断体内同源基因表达，致使mRNA降解和基因表达受抑。自然界中，RNAi可能是动植物体内的一种保护机制，主要作用在于防御病毒感染，维持基因组中转座子的稳定，参与胚胎发育等(Elbashir et al., 2001)，此后诱导参与基因遗传中或后天失调的信使RNA降解的RNA干扰疗法便迅速发展起来，同时有研究证明RNAi技术有很多非常适合作为抗病毒治疗的原因(Leonard and Schaffer, 2006)，所以本研究选择shRNA基因作为该新型病毒疫苗的一个重要基因。

　1.4 γ干扰素与口蹄疫免疫

　图3：IFNr 在APC与T细胞和B细胞作用机制中的作用(索布林那，2009)

　Fig：The role of IFN-γ in the mechanism APC with T cells and B cells

　γ-干扰素(Iterferon-γ，IFNγ)具有免疫干扰素之称，其受体是特异性的糖蛋白(Harris et al., 2005)，有广泛的抗病毒和免疫调节功能。特异性免疫反应被激活时，T细胞产生包括γ-干扰素在内的与免疫应答相关的细胞因子(Sainz et al., 2005)，IFN-γ可使巨噬细胞表面MHC类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体促进B细胞和CD8T细胞的分化增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；对TH2细胞的增殖有抑制作用，抑制TH2细胞产生IL-4IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。β、γ三种干扰素激发的基因有所相似，然而它们调节的很多基因仍然存在一定的差异(Der et al., 1998)，其中β干扰素所激发的基因是а干扰素的两倍，此种干扰素诱导基因的不同也部分解释了β干扰素比а干扰素具有更好抗PRV的现象。空斑形成单位及病毒增殖试验的结果均显示猪β干扰素是三种干扰素中对抗PRV最有效的细胞因子（姚清侠β强(Jarosinski and Massa, 2002; Giroux et al., 2003)，在抗体产生的信号通路中起到免疫调节作用对中和抗体的产生有很大的意义，研究表明牛γ-干扰素(BoIFN-γ)在重组口蹄疫疫苗中可显著提高体液和细胞免疫反应(Shi et al., 2006)，故本研究选用猪γ干扰素基因与其它功能基因重组在口蹄疫疫苗中有很大意义。

　从图3可以看出IFN-γ在抗口蹄疫过程中的作用机理：当活FMDV或灭活FMDV疫苗侵染机体时一部分在体液免疫阶段被消灭掉，另一部分在APC的作用下促使细胞产生MHCII、IL-1，被T细胞表面的TCR识别后促进干扰素γ的分泌，同时干扰素γ能促使T细胞分泌干扰素γ，此时T细胞增殖并分泌细胞因子IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6，这些细胞因子刺激B细胞使其分泌大量的特异性抗FMDV的抗体，这些特异性抗FMDV的抗体与吸附在APC表面被传送到此处的活FMDV或灭活FMDV疫苗结合产生免疫反应。在此过程中，IFN-γ不仅是一种有效的免疫佐剂，同时也是重要的免疫调节分子，它不仅能增加细胞免疫应答，最重要的是能增加疫苗介导的针对特异性病原体攻击的保护性，另外显著增强抗原递呈细胞膜表面MHCI、MHCⅡ类抗原表达，因而激发更有效的抗原递呈过程。

　1.5 FMD疫苗研究进展

　在的防控中疫苗接种特异性预防可靠工具和有效手段，取得了显著成效FMD的爆发就是由于病毒灭活不完全或是由于活病毒从生产场地逃逸而造成的（孙元，2006）；（3）易出现病毒毒力返强或减毒株突变现象。这些局限性限制了传统疫苗在畜牧业中的应用。为了克服这种种弊端，各种FMD新型疫苗特别是基因工程疫苗被逐渐开发出来，如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗IFN-γ基因、靶点位于FMDV 3B区段的shRNA和两个串联起来的FMDV抗原基因 P1-UbP1共同插入到转移载体PIECMV中，然后和伪狂犬缺失株PRV TK-/gE-/LacZ+共转染，通过空斑筛选的方法得到能够双表达O型口蹄疫抗原基因P1基因和跟泛素基因融合的Ubi-P1基因，同时又能表达猪IFN-γ基因以及产生针对O型口蹄疫3B区段的RNAi效应，来共同达到最终的抗病毒效果。

　2实验材料

　2.1菌种、毒株、载体与质粒

　伪狂犬弱毒疫苗株PRVTK-/gE-/LacZ+由农业微生物学国家重点实验室构建保存。该突变株是将PRVEa株TK基因缺失205bp，并在gE编码区插入LacZ表达盒，导致gE失活的基因缺失标志性疫苗株。

　本研究所用工程菌DH5a、XL-gold由本实验室保存。

　载体PIECMV由本实验马锐硕士研究生构建。

　pUC57pansUbiP12A由上海英骏公司合成。

　pCAsIFNgsiF由本实验室郝根喜硕士研究生构建。

　pCApansUbiP12AsiF由本实验室郝根喜硕士研究生构建。

　猪肾传代细胞PK-15与非洲绿猴肾细胞Vero购自中国典型物保藏中心。

　2.2主要药品与试剂

　新生牛血清(NCS)购自杭州四季青材料有限公司，使用前经56℃灭活30min。

　培养细胞用的DMEM粉剂为GIBCO公司产品。

　氨苄青霉素(Amp)、胎牛血清均为Invitrogen公司产品。

　各种限制性内切酶、连接酶、Taq酶、DNA Marker均为大连宝生物公司产品。

　DNA回收试剂盒为TaKaRa公司产品。

　质粒小量和大量制备试剂盒为OMEGA公司产品。

　脂质体转染试剂盒LIPOFECTIN2000和无血清培养基OPTI-MEM均为Invitrogen公司产品。

　2.3主要培养基及配制

　LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母浸出物5.0g，NaCl10.0g，溶于ddH20中，完全溶解后用5mol/LNaOH调pH值至7.0-7.2，定容至 1000.0mL，在15磅高压下蒸气灭菌20min，室温保存。

　LB固体培养基：在刚配好尚未灭菌的LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高压蒸气灭菌20min。待培养基温度降至50℃左右，加入相应的抗生素，铺制平板。待培养基凝固后，倒置于4℃保存备用。

　DMEM基础培养液(用于常规细胞培养)：取DMEM粉末(Gibic, USA)13.5g溶于950 mLddH2O中，加入3.7g NaHCO3，用1mol/L HCl调pH值至6.8-7.0，定容至1000.0 mL，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后室温保存备用。

　DMEM细胞生长液：在DMEM基础培养液中加入10%的已灭活新生牛血清、100μg/mL青霉素、100μg/ mL链霉素，4℃保存备用。

　DMEM细胞维持液：在DMEM培养液中加入1%-3%的新生牛血清、100μg /mL青霉素、100μg/mL链霉素，4℃保存备用。

　细胞消化液：将NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4 0.2g、胰酶2.5g，依次溶于900.0mLddH2O中，待完全溶解后，定容至1000.0mL，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后置-20℃保存备用。

　2.4缓冲液及其配制

　TAE(50×)：242.0g Tris碱，57.1mL冰乙酸，100.0mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加ddH2O定容至1000.0 mL。

　PBS Buffer：将NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.42g、KH2PO4 0.27g溶于800.0mLddH2O中，待完全溶解后，滴加浓HCl调节PH至7.4，定容至1000.0mL，高温高压灭菌后室温保存。

　10%SDS：称量10g高纯度的SDS溶于80mLddH2O中，68℃加热溶解后，滴加浓HCl调节PH至7.2，定容至100.0mL，室温保存。

　0.5 M EDTA：称取186.1g Na2EDTA. 2H2O溶于800.0mLddH2O中，充分搅拌，滴加NaOH调节PH至8.0，定容至1000.0mL，高温高压灭菌后室温保存。

　2.5其他溶液

　TEN：100.0mol/LNaCl，10.0mol/LTris-Cl，1.0mol/LEDTA(PH 8.0)

　LCM：30.mol/LTris(PH7.5)，5.0mol/LMgCl2，3.6mol/LCaCl2，0.5mol/LEDTA 6.0 mmol/Lβ-MoracPtoethnael，0.5%NP-40，125.0mol/LKCI

　空斑筛选PCR样品细胞裂解液：0.5%SDS，100.0mmol/LNaCl，10.0mmol/L Tris-CL，1.0mmol/LEDTA，0.25mg/mL蛋白酶K。

　2.5空斑筛选与纯化相关试剂

　2×DMEM（无酚红）：称取13.4g无酚红的DMEM粉剂，溶于约400.0 mL三蒸水中，再加入3.7g NaHCO3，用浓盐酸调PH值至6.8-7.0，定容至500.0 mL，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后4℃保存备用。

　低熔点琼脂糖（2%）：称取2.0g低熔点琼脂糖粉剂，溶于100.0 mL三蒸水中，高温高压灭菌30min后室温保存（用前于70℃水浴锅中融化或微波炉小心融化）。

　蛋白酶K（20mg/mL）：取100mg蛋白酶粉剂，溶解于5.0 mL三蒸水中，分装小份，保存于-20℃。

　10%SDS(M/V)：称取10gSDS粉末，溶解于100.0 mL去离子水中，室温保存。

　0.5mol/LEDTA：称取18.61g EDTA-Na. 2H2O粉末，溶于约80.0 mL水中，NaOH调PH至8.0后定容至100mL，室温保存。

　空斑筛选PCR样品细胞裂解液：05%SDS，100.0mmol/LNaCl，10.0mmol/L Tris-CL，1.0 mmol/LEDTA，0.25mg/mL蛋白酶K。

　2.6寡核苷酸引物

　本实验PCR所使用的寡聚核苷酸引物如表1。

　表1：本研究中所用的寡核苷酸引物

　Table 1:The oligo primer used in the research

　编号 序列 用途 R primer

　F primer 5- AGCTTTGCGTGACTTTGTGTTTTTC- 3’

　5- GCAGGGGGCTGTTTCATATACTGAT- 3’ 鉴定阳性重组子 3实验方法

　3.1转移载体PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建策略

　重组转移载体PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建流程如图4所示

　图4：转移载体PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ构建流程

　Fig.4：Building process of PIECMVUbi1P1SiFIFNγ

　3.1.1限制性内切酶酶切反应

　酶切产物仅用于检测时，取1μL质粒DNA并加入相应的限制性内切酶反应缓冲液，混合后加入限制性内切酶，指弹混合，瞬时离心后置于37℃水浴3h。若酶切产物用于回收，根据实际情况可增加质粒的量扩大酶切反应体系。

　3.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测

　配制0.8%琼脂糖凝胶（胶的浓度要根据目的条带的大小适当调整，如果是大片段则需浓度低的琼脂糖凝胶）：20mLddH2O中融入400μL（50×）TAE，再加入0.16g琼脂糖，加热至完全溶解，稍微冷却后加入适量EB。凝胶倒入胶槽，如有气泡用梳子赶走，插好梳子，等待凝胶冷却凝固。拔出梳子，凝胶放入装有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽，确保缓冲液要淹没凝胶。然后取酶切产物1.5-3μL与微量6×loading buffer混合，加于点样孔中，同时取约2μL的DNA Marker点样作对照。以100-120V电压进行电泳。待溴酚蓝电泳到凝胶2/3处时，则可结束电泳。取出凝胶于凝胶成像系统拍照，保存照片。

　3.1.3酶切产物的回收

　酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确后，于长波紫外灯下切取目的条带用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收获得目的DNA片段（具体回收方法参考该试剂盒说明书）。回收过程如下：

　（1）将切下的目的DNA条带放入1.5mL离心管；（2）加入600μLPN液，50℃水浴10min，翻转离心管使充分溶解；（3）将上步所得溶液加入吸附柱，室温静置2min后12000r/min离心60sec，弃废液；（4）加入600μLPW液，静置5min后12000r/min离心60sec，弃去废液；（5）再次加入600μLPW液，12000r/min离心60sec，弃去废液；（6）12000r/min离心2min，开盖静置5min；（7）弃掉收集管，将吸附柱放入离心管，悬空滴加30-50μLEB洗脱液（或ddH2O），37℃温箱静置5min。（8）12000r/min离心2min收集DNA溶液，离心管标记保存。

　3.1.4回收产物的去磷酸化反应

　在做分子克隆时，为防止单酶切制备的载体在连接反应时发生自连，我们需将载体进行去磷酸化处理。具体步骤：回收时溶34μL ddH2O在50μL体系中加入2μL CIAP，4μLBuffer置于37℃反应30min后加入1μLCIAP置于50℃反应15min，用试剂盒进行液体回收溶20μL ddH2O，跑胶检测。

　3.1.5目的基因与载体的酶连反应

　将回收所得的DNA片段与载体用T4 DNA连接酶进行连接，酶连体系根据大连宝生物工程有限公司提供的T4 DNA连接酶的说明书进行配备，如表2所示。

　表2：目的基因与载体酶连体系

　Table 4：reaction system of Enzyme with target gene and vector

　μL） 载体

　目的基因

　T4 DNA Ligase(2~5U／μL)

　10×T4 DNA Ligase Buffer

　ddH2O

　Total 1

　4

　1

　2

　12

　20 置于16℃或4℃过夜。

　3.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化

　3.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）

　从大肠杆菌DH5α平板中挑取一个单菌落，接种于2mLLB液体培养基中，37℃200r/min摇床振荡培养过夜，按1：100转接到装有50mLLB的盐水瓶中，继续培养约3-4h，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，冰上放置30min，于4℃4000r/min离心10min。弃上清，将离心管倒置1min使残留培养液流尽。加10ml 冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬沉淀，冰浴30min后，4℃4000r/min离心10min。弃上清，沉淀中加入2mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬。悬浮的感受态细胞可马上用于转化。如保存，则需加入无菌甘油到终浓度为15%，分装0.1mL/管，-80℃冰箱保存备用。

　3.2.2质粒的转化

　将载体与cDNA或DNA基因片段的连接产物与100μL感受态细胞混匀，冰浴30min；42℃水浴热冲击90sec；冰浴2min；若是转化质粒，则取30～50μL菌液直接涂布含相应抗生素的LB平板；若转化连接物，则加入0.4mL 37℃预热的LB培养基，37℃振摇培养45min；5000r/min离心3min，弃去450μL的上清后，将剩余的部分直接涂布含相应抗生素的LB平板，37℃培养12～16h后，出现转化菌落。

　3.2.3质粒的小量制备(OMEGA试剂盒) 　

　（1）(1)将带有质粒的E.coil接种于100-200mLLB∕抗生素培养液中，37℃摇床培养12-16h。(2)取100-200 mLLB菌液，室温下3,000-5,000g离心10min收集菌液。(3)倒弃培养基，加入10mLSolutionI∕RNaseA混合液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。(4)往重悬混合液中加入10mLSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀10-15次后可将混合液室温放置2min以提高产量。(5)加入5mL冰浴BufferN3，并温和颠倒离心管数次至形成白色絮状沉淀。准备好过滤器。(6)把HinBind大量柱套在收集管中，加入5mLBuffer GPS至柱中，静置3-10min。室温3,000-5,000g离心5min。去滤液，把柱子重新放回收集管中。(7)把裂解液倒入事先准备好的针筒过滤器中，静置2min。(8)插入并轻推活塞使裂解液流进下面的收集管中。(9)在过滤澄清的裂解液中加入1∕10体积的ETR，颠倒7-10次后溶液变得浑浊，冰浴10min。(10)42℃水浴5min后，25℃3,000-5,000g离心5min，ETR溶液将在管底形成蓝色分层。离心后，如果溶液有大量的液滴悬浮，静置10min让液滴自然沉降。(11)转移上清液至离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀后室温静置1-2min。(12)取一干净的HinBind 大量柱装在50mL收集管中。转移20mL混合液至柱子内，室温下3,000-5,000g离心3-5min，倒去滤液。(13)重复第（12）步，把剩余的过滤液转移至柱子，直至所有的溶液都从柱子滤出。(14)把柱子重新放回收集管，加入10mLHB Buffer，按上述条件离心，弃滤液。(15)把柱子重新放回收集管，加入15mLDNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃滤液。(16) 弃去滤液，重复步骤（15）一次。（17）弃去滤液，把柱子重新放回收集管，最大速度（≤6,000g）离心10-15min以甩干柱子基质。（18）把柱子放在干净的50mL离心管中，加入1-3mLElution Buffer，弃上清，室温下静置2min后最大速度（≤6,000g）离心5min以洗脱DNA。

　3.2.5阳性质粒的酶切鉴定

　挑取转化的菌落，接种于mL含相应抗性的LB液体培养基中。37培养过夜，小量制备质粒DNA，用合适的限制性核酸内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯观察，鉴定重组质粒。CO2培养箱静置培养，6h换新生长液（已预热）继续培养。）

　3.3.2 PRV TK-/gE-/LacZ+基因组DNA的提取

　将PRV弱毒株TK-/gE-/LacZ+接种于已长成单层的PK-15细胞，37℃培养至80%的细胞出现病变，用吸管吹打使细胞从瓶壁上脱落，在4℃8000r/min离心15min收集细胞。将细胞沉淀重悬于细胞裂解液LCM使细胞裂解，冰浴5-10min后，加入三氯三氟乙烷抽提，摇匀5min，4℃3000r/min离心10min，吸取上清于另一干净离心管，再加入三氯三氟乙烷抽提一次，摇匀5min，4℃3000r/min离心10min，取上清，4℃8000r/min离心10min，取上清，加到5%-45%的甘油梯度上（加入的上清体积不超过甘油体积的10%），在电子天平上平衡，26000r/min离心2h，小心弃去上清，将沉淀重悬于TEN缓冲液后，加入10%的SDS至终浓度为0.5%，室温作用30min，加入等量饱和酚，轻轻摇动约10min，10000r/min离心10min，吸取上清于另一离心管，用等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次，取上清加入2倍体积的无水乙醇，混匀置-20℃ 3h或过夜，于4℃10000r/min离心20min，弃去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥后，溶于适量的含RNaseTE中，置37℃ 1h，最后贮存于-20℃备用。

　3.3.3脂质体介导的共转染

　利用脂质体介导法按其试剂盒说明书进行。在24孔细胞培养板中培养细胞，于转染前4h，即细胞单层长至40%~60%，换新鲜培养基继续培养。转染时，取2个1.5m的无菌Eppendorf管，管A加入1~2μg 1~2μg基因组和50μ无血清培养基OPTI-MEM，管B加入3μ LIPOFECTIN Reagent和50μL无血清培养基OPTI-MEM于室温作用5min。随后，将管B中的试剂加入至管A，室温作用20min。在混合物作用20min过程中，吸弃24孔培养板中的培养基，用不含血清的DMEM洗涤细胞1次。将混合物加至细胞单层，于37，5%CO2培养箱中培养6h，然后吸弃细胞培养物上的液体，加入完全培养基继续培养至细胞病变。

　图5：重组病毒的空斑纯化及PCR鉴定流程

　Fig.5: Process of Plaque purification and PCR of recombinant virus

　将出现细胞病变的共转染产物反复冻融3次，分别取400μL接种至6孔细胞培养板的PK-15细胞单层，于37吸附1h，倾去培养液，用无钙镁的PBS洗3次，每孔覆盖低熔点琼脂糖2.5mL，置37 CO2培养箱培养，待空斑形成后（约48h），挑取单个空斑于200μL维持液中，置-20反复冻溶2~3次，接种于PK-15细胞已长成单层的24孔细胞培养板中培养，待细胞病变后，PCR扩增IFN-γ基因进行鉴定，μL上清病毒液。（2）每孔加入10μL10% SDS，10μL 0.5moLEDTA，1.3μL蛋白酶k，50℃作用1h，或37℃作用6h以上(过夜)。（3）加等体积(220μL)酚：氯仿：异戊醇抽提一次，12000r/min离心10min，取上清加1/10体积3MNaAc(PH5.2)和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min以上。（4）12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500μL70%乙醇洗一次，12000r/min离心10min，弃上清，烘干，每管加入20μL ddH2O溶解。

　3.3.6重组病毒PCR鉴定

　取重组病毒基因组DNA用作模板进行PCR扩增，反应结束后，将PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统观察并制得凝胶图片。筛选阳性重组子。口蹄疫病毒IFN-γ基因PCR扩增体系条件如表5和表6所示。

　表5：重组病毒PCR鉴定的反应体系

　TabLe 5：reaction system of identification of recombinant virus by PCR

　反应体系 体积（μL） 备注 DNA模板

　10×PCR buffer

　dNTP Mixture

　F primer

　R primer

　rTaq酶

　ddH2O

　TotaL 10

　5

　2

　2.5

　2.5

　0.5

　27..5

　50 10×PCR buffer成分：

　Tris-HCI(PH8.3)100mmol/ L ,KCI500 mmol/L，MgCl215 mmol/L。

　dNTP Mixture成分：各2.5mmol/L，以PH7.0-9.0的Na盐水溶液状态存在。

　F primer和R primer由上海生物工程公司合成：

　Nmol分别为：4.1和4.5。

　rTaq酶：5U／μL。

　表6：重组病毒PCR鉴定反应条件

　TabLe 6：reaction conditions of identification of recombinant virus by PCR

　PCR过程 温度（℃） 时间 循环数 预变性

　变性

　退火

　延伸

　再延伸

　结束 94

　94

　55

　72

　72

　4 3min

　1min

　45s

　45s

　10min

　forever

　}共30个循环

　 反应结束后，将PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统观察并制得凝胶图片。

　4结果与分析

　4.1转移质粒PIECMVUbiP1的构建

　通过限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ和ScaⅠ酶切质粒pUC57pansUbiP12A得到UbiP12A基因，通过限制性内切酶BglII和XhoI双酶切PIECMV，通过同尾酶的平端连接等原理将UbiP12A基因连入载体PIECMV。所得转移质粒PIECMVUbiP1用BamHⅠ酶切检测与预期结果相符，表明成功构建转移质粒PIECMVUbiP1。

　图6：重组质粒PIECMVUbiP1酶切鉴定

　Fig.6: Identification of PIECMVUbiP1digested

　M1：DNA marker（DL5000）M2：DNA marker（DL15000）

　1-6：1-6号小提质粒经BamHⅠ酶切结果，片段大小为：8400bp、903bp

　4.2转移质粒PIECMVUbiP1P1的构建

　通过限制性内切酶BglII酶切pCApansUbiP12AsiF得到P12A基因，通过限制性内切酶BamH酶切质粒载体PIECMVUbiP1，将酶切回收后的质粒进行去磷酸化处理，将P12A基因连入载体PIECMVUbiP1。所得转移质粒PIECMVUbiP1P1用XhoI检测并判断P12A基因连进去的方向是否与启动子的方向一致。结果与预期相符，表明成功构建转移质粒PIECMVUbiP1P1。

　图7：重组质粒PIECMVUbiP1P1酶切鉴定

　Fig.7: Identification of PIECMVUbiP1P1digested

　M：DNA marker (DL 15000)

　I酶切检测P12A基因连进去的方向片段大小为：8597bp、3192bp

　4.3转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建

　通过限制性内切酶SalⅠ、ScaⅠ和HindⅢ酶切质粒pCAsIFNgsiF得到sIFNgsiF基因，通过限制性内切酶SalⅠ和HindⅢ酶切质粒PIECMVUbiP1P1，将sIFNgsiF基因连入载体PIECMVUbiP1P1中，构建转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ。转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ通过BglII单酶切鉴定，通过XhoI单酶切鉴定，通过HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定，电泳条带大小均与预期相符，结果表明UbiP12A基因、P12A基因、sIFNgsiF基因已成功克隆到载体PIECMV中，转移载体PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ构建成功，酶切鉴定结果如图8所示：

　图8：重组质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ酶切鉴定

　Fig.8: Identification of PIECMVUbiP1P1SiFIFNγdigested

　M：DNA marker (DL 15000)

　1：经BglII酶切片段大小为：11704bp、3070bp、77bp

　2：经XhoI酶切片段大小为：6240bp、5419bp、3129bp

　 3：经HindⅢ和EcoRI酶切片段大小为：13495bp、1356bp

　4：PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ质粒胶图

　4.4共转染产物接毒第三代PCR鉴定

　将转染产物接于长满单层细胞的细胞瓶中，培养至第三代病变后收取细胞进行病毒基因组提取，根据核苷酸序列设计一对引物F primer和R primer扩增重组病毒IFN-γ基因部分片段，PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，结果表明，扩增出大小716bp 的基因片段，与预期大小(716bp)相符（如图9所示）。说明转染成功，存在能稳定增殖的阳性重组病毒，可接着进行空斑纯化实验。

　图9：转染产物接毒第三代基因组PCR鉴定

　Fig.9: Identification of transfection products by PCR

　1：口蹄疫病毒IFN-γ基因 M：DNA marker (DL 2000)

　4.5重组病毒的空斑纯化及PCR鉴定

　4.5.1空斑的形成

　共转染48小时后细胞出现病变，收获转染产物，冻融后作连续10倍稀释，将10-2-10-7稀释度的病毒液接种于长满单层PK-15细胞的6孔板上，吸附后覆盖低熔点琼脂糖37℃二氧化碳培养箱培养2d后，肉眼可见明显的空斑，其中在10-5稀释度形成的空斑数目适宜，便于挑选空斑（如图10所示）。

　图10：空斑照片

　Fig.10:Plaque photo

　4.5.2在PK-15细胞上的第一轮空斑筛选

　在10-4、10-5和10-6稀释度形成的空斑中挑出24个空斑接种于80%长满单层24孔板的PK-15中进行重组病毒的扩增，48h收毒。重组病毒第一轮空斑筛选的PCR鉴定电泳结果如图11所示。挑选出其中的阳性重组病毒，做下轮的空斑筛选。

　图11：重组病毒第一轮空斑筛选的PCR鉴定

　Fig.11:identification of the first bye spot screening of recombinant virus by PCR

　M：DNA marker (DL2000)

　图12：重组病毒第一轮空斑筛选的PCR鉴定

　Fig.12:identification of the first bye spot screening of recombinant virus by PCR

　M：DNA marker (DL2000)

　1-23：为1-23号空斑扩增病毒的基因组作为模板PCR结果

　4.5.4 重组病毒的空斑筛选结果

　本研究将构建的转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ通过共转染成功获得了阳性重组病毒，重组病毒进行了第一轮空斑筛选，在PK-15和Vero细胞上阳性率分别达到5／24=20.8%和5／23=21.7%。

　5讨论

　5.1 载体的构建

　在做载体的构建时，为了提高连接效率和连接时的准确性我们可以通过以下几个方面来巧妙设计实验：（1）同尾酶的利用。当载体和含亚克隆片段的质粒中不含相同的酶切位点而含有能切出互补粘性末端的同尾酶位点时，我们可以利用同尾酶来获取含互补粘性末端的片段和载体用于连接。（2）载体的去磷酸化反应。当用于连接亚克隆片段的载体用只用一种内切酶时，为防止载体自连我们需要将其进行去磷酸化处理，以此降低连接反应中载体自连的可能性，提高载体和片段的连接效率。（3）连接方向的鉴定。当载体和目的片段酶切后均只产生一种粘性末端，我们可巧妙选择内切酶，酶切鉴定目的片段连进去的方向是否和载体启动子的方向一致。（4）连接反应时的温度和时间。大多数连接反应条件为16℃过夜，由于本实验构建转移质粒比较大，构建的难度相应较大，尤其是连接反应失败的次数很多，所以在摸索一系列反应的条件后得出根据构建载体大小等的不同我们也可以将连接反应温度设为4℃，时间可控制在8-48小时范围内的结论。

　构建好了的载体为了确定没有碱基的突变一定要测序，之后将相应的菌液和质粒贴好标签保存好。通常用的内切酶效价在10U∕μL左右，1μL内切酶相当于10U，足够切4μL的质粒，所以在使用酶时我们要坚持做到微量不浪费，同时注意始终保持在冰上操作以防酶失活。当构建载体出现很长时间也不能构建成功时，自己首先需要思考反应体系中每种试剂用量是否正确、反应条件是否得当等。

　5.2 细胞的传代培养

　本研究所用到的PK-15和Vero细胞都有很好的生长和增殖能力，并可以无限传代，但要想获得形态和活性均很好的细胞，细胞传代的细节尤为关键。

　像大多数细胞系一样，PK-15和Vero细胞在传代培养时首先用PBS缓冲液洗2-3遍，加适量胰酶放于37℃培养箱消化后加适量的细胞培养液吹打细胞至在显微镜下看到以1-3个细胞为分散状为止，然后按1：3左右的比例分装培养。但二者细胞传代过程的差别正如大多不同种类的细胞传代过程一样，就是胰酶消化过程的差别。当细胞消化不好时，会出现细胞呈团块贴壁生长，分布不均匀，当细胞消化时间过长容易老化，形态差，活性低。而细胞的消化好坏很大程度上取决于胰酶的添加量以及消化时间，当胰酶添加的量过多时，细胞很容易大块的从瓶壁上脱落团块状，这样胰酶就不能均匀的分布在细胞表面，致使即使吹打多次仍不能分散成单个细胞，在这种情况下，增加消化时间显得有必要，但时间过长会造成细胞膜的过度消化，细胞活性降低甚至裂解。因此消化过程中胰酶的添加量和消化时间对于不同种类的细胞一定要有一个很好的把握才能培养出形态和活性都很好的细胞。

　5.3 空斑筛选实验

　5.3.1 空斑筛选细胞的选择

　由于针对猪O型口蹄疫重组伪狂犬病毒的基因工程疫苗，其中最为有代表受用作用的是猪，基于此等原因，用于此类重组病毒空斑筛选等一系列实验最常用的是PK-15细胞，众多的实验结果表明选择此种细胞对一般重组病毒的筛选是无副作用的，所以本研究共转染后的阳性重组病毒直接选择用PK-15细胞筛选。同时考虑到本研究构建的重组病毒中含有γ干扰素基因，而PK-15细胞含有α、β、γ干扰素基因的编码区，可能会调控该重组病毒干扰素基因的一系列包括表达、调控、免疫等生理过程，对病毒自身的生长起到抑制作用，不利于阳性重组病毒的获得，故同时选用另一种也很常用的Vero细胞用于该研究重组病毒的筛选。

　从空斑筛选实验及病毒基因组PCR扩增结果可以看出，γ干扰素并未能影响PK-15细胞的生长，故选用该种细胞作为载体理论上能用于该重组病毒的筛选。

　5.3.2 RNA干扰对空斑筛选结果的影响

　有实验表明，添加外源合成的siRNA分子到哺乳动物细胞能诱导特定的RNA干扰(ELbashir et al., 2001)，但由RNA干扰的原理以及生物的自我保护机制知，利用siRNA基因在哺乳动物细胞的调节作用下合成的siRNA分子理论上不会对哺乳动物细胞本身的生长产生副作用。在空斑筛选实验过程中，含有shRNA基因的重组病毒载体始终在无完整代谢调节功能的细胞系上生长，整个过程中shRNA基因能否正常表达出来都不确定，同时本研究选用的是针对O型口蹄疫3B区段的RNAi效应，对哺乳动物细胞mRNA互补的可能性很小，所以shRNA基因对空斑筛选实验结果不会产生很大影响。

　5.3.3干扰素γ对空斑筛选结果的影响

　有研究表明将牛γ-干扰素(rBoIFN-γ)基因和VP1基因重组在口蹄疫疫苗中，可在毕赤酵母中融合共表达，并且表达产物以一个很高的浓度分泌到培养基的上清中，可显著提高在小鼠身上诱导的体液和细胞免疫反应(Shi et al., 2006)。

　此项研究首先说明了融合了γ-干扰素基因的FMDV疫苗能够增强机体的免疫反应，其次也说明了γ-干扰素基因并不会影响酵母这一类真菌及小鼠这一类哺乳动物的正常生长活动，其次FMDV疫苗在筛选的过程中形成的空斑状态很好，所以γ-干扰素基因不干扰重组基因组口蹄疫疫苗自身的生长，但从空斑的PCR结果图可看出在PK15细胞上的空斑筛选能够提取出细胞的基因组，而在Vero细胞上的空斑筛选基本不能提取出细胞的基因组，所以重组病毒中的γ-干扰素基因对其宿主细胞的生长是否有影响，还需后续实验进一步验证。

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　致 谢

　本论文是在导师钱平教授的悉心指导和严格要求下完成的。自大学三年级开始在导师研究室学习，切身体验了导师对科学研究的兴趣和热爱以及导师渊博的学识、敏锐的科学洞察力、敢于创新的学术作风、富有策略而卓有建树的工作、勤奋敬业的精神、宽厚仁爱的学者风范。谨在此向导师致以最诚挚的敬意和衷心的感谢!感谢导师两年来对我在学业上的悉心指导和生活上无微不至的关怀，并为我提供良好的学术环境和宽松的学习氛围，让我在学习方面取得了很大的进步，在综合素质方面得到了很大的提高。

　衷心感谢李祥敏老师在研究工作中所给予的细致指导、支持和帮助。在研究室期间她多次与我讨论研究的相关内容，及时与我探讨解决实验中出现的种种问题，并对论文的进展提出很多建议，给了我很大的帮助，她深厚的学术功底以及朴实无华、平易近人的人格魅力使我对她倍感敬仰。

　衷心感谢本室郝根喜硕士研究生，感谢他在课题的设计、实验过程中以及论文写作和修改过程中所给予的具体指导、支持和帮助。两年以来，他对我在学习上悉心的指导生活上无微不至的关怀，使我不仅在实验技术方面得到很大提高而且在各方面都得到了成长，他严谨的学术作风、积极的生活态度、宽广豁达、爽朗博爱的性格等使我受益良多。

　衷心感谢本室马锐、杨应立、张华伟、刘伟芳、曹齐树、朱巧艳硕士及全体实验室同学在实验中所给予的指导、帮助与协作，实验室团结友爱的氛围，相互协作、积极向上的精神，将让我永远怀念在此与度过的时光。

　同时，我要特别感谢我的父母，他们在我学习和生活过程中一直是我坚强的后盾，从精神和物质上都给予我全力的支持，他们的关爱和鼓励将永远激励着我.

　最后，再次衷心感谢所有给予我关心、支持与帮助的各位领导、老师、同学、

　同事和朋友们!

　华中农业大学本科毕业论文

　14

　III

　13

　M1 1 2 3 4 5 6 M2

　M

　1

　M

　M

　1

　2

　3

　4

　 M 1

　500bp

　750bp

　正常细胞

　空斑

　M + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

　750bp

　M + - 23 24

　750bp

　M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

　750bp

　P12A

　UbiP12A

　sIFNgsiF

　pUC57pansUbiP12A

　pIECMVUbiP1P1SIFIFNγ

　pCAsIFNgsiF

　pCApansUbiP12AsiF

　PIECMV载体

　500bp

　500bp

　500bp

　500bp

　15000bp

　10000bp

　7500bp

　5000bp

　2500bp

　1000bp

　7500bp

　5000bp

　2500bp

　10000bp

　7500bp

　1000bp

　接24孔板

　5000bp

　1000bp

　提基病毒因组，PCR检测

　阳性率达到100%

　下一轮空斑纯化

　实验

　挑取空斑22个

　将经PCR检测为阳性的转染产物

　以10-4-10-6 接长满90%细胞的六孔板。

　发生病变

　冻融两次

　24-36h后