【甘康冲剂对小鼠免疫性肝损伤的保护作用】 免疫性肝损伤能治愈吗

　　[摘要]目的研究甘康对小鼠免疫性肝损伤的保护作用及可能机制。方法用BCG+LPS建立免疫性肝损伤小鼠模型,用分光光度法检测血清中ALT、AST水平和肝匀浆GSH-px、SOD含量。结果甘康(200、400和800 mg・kg-1×10d)灌胃给药均能降低血清中升高的转氨酶水平,减轻肝组织坏死范围和程度,减少炎细胞浸润,使升高的肝指数降低,甘康还可降低肝匀浆MDA含量,使降低的肝匀浆GSH-px、SOD活性升高。结论甘康冲剂对药物致免疫性肝损伤具有保护作用,其机制与其抗自由基等有关。
　　[关键词] 甘康; 免疫性肝损伤; 机制
　　[中图分类号]R965[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515(2010)-8-166-02
　　
　　甘康冲剂系临床验方,由柴胡20 g、丹参20 g、甘草6 g、广郁金20 g、赤芍10 g、茯苓10 g组成,益气活血,养血柔肝。为方便患者取用,我们采用江苏江阴药业有限公司生产的中药单味饮片浓缩干粉直接混合、冲服,该产品的生产工艺及质量标准均符合国家药监局的要求。因浓缩干粉用量小于中药饮片,按厂家规定的与中药饮片换算标准,该冲剂的用量为柴胡3 g、丹参3 g、甘草1 g、广郁金1 g、赤芍1 g、茯苓1 g。为从基础实验上探讨该冲剂的相关功效及作用机制,为进一步的开发提供实验支持,我所采用了卡介苗(Bacillus Calmette Guerin, BCG)和脂多糖(lipopo-lysaccharide, LPS)诱导的免疫性肝损伤模型,观察了甘康对该模型的保护作用,初步探讨其可能的作用机制。
　　1材料
　　1.1药物甘康冲剂(由柴胡、丹参、甘草、广郁金、赤芍、茯苓组成,其成分比例为:3:3:1:1:1:1),由蚌埠医学院第二附属医院提供,临用前用双蒸馏水溶解。葵花护肝片:由黑龙江葵花药业股份有限公司生产,批号:20041015,临用前用双蒸馏水溶解至所需浓度。生理盐水,由上海华源长富药业(集团)有限公司生产,批号:20050321。
　　1.2 试剂BCG系卫生部上海生物制品研究所产品,LPS系美国Sigma 公司产品,临用前用生理盐水稀释,批号:20050312;丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)测定试剂盒,批号:20050804;天冬门氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)测定试剂盒,批号:20050810;丙二醛(malondiadehyde MDA)测定试剂盒,批号:20050805;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测定试剂盒,批号:20050602;谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)测定试剂盒,批号:20050606;均为南京建成生物工程研究所产品。
　　1.3动物昆明种小鼠,♂,体重20～24g,普通级,安徽医科大学实验动物中心。在恒温(22～28℃)、光照正常环境中饲养一周后实验,实验前24h禁食,任意饮水。
　　1.4仪器与设备TDZ4-WS台式低速离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司产品;756可见紫外分光光度计,上海分析仪器厂产品;DIA X-900型内切式组织匀浆机,德国Heidolph公司产品;电热恒温水浴锅:上海医疗器械五厂产品。
　　2方法
　　2.1 BCG/LPS致小鼠免疫性肝损伤模型的建立造模第1天给昆明种雄性小鼠经尾iv BCG 2.5mg/0.2ml/只(0.2ml/只约含5.0×107个活菌数),10d后每次尾iv LPS 7.5μg,0.2ml/只。禁食16h后处死动物,自小鼠后眼睛静脉丛采血,测定血清转氨酶活性;取肝脏、脾脏称重,计算肝脏指数和脾脏指数,另取小块肝脏组织,用冷生理盐水洗去浮血,拭干,称取0.5g肝组织,用冷生理盐水制成10%的肝匀浆待用。
　　2.2动物分组及处理设正常对照组、模型组、甘康给药组(200、400、800 mg・kg-1 3个剂量)和阳性对照组即葵花护肝片(1000 mg・kg-1)。将动物按体重随机分组,每组10只。用药方案:自造模前1周起,按20 ml・kg-1体积分别给予不同剂量药物,ig给药,每天1次,末次给药在iv LPS激发肝损伤前,共10次;正常对照组和模型组给予等量溶媒。
　　2.3 观察指标ALT,AST,MDA,SOD和GSH的测定采用分光光度计法测定,严格按试剂盒说明书的操作步骤进行操作;肝脏病理组织学观察:处理小鼠后,取小块肝脏用10%甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察肝脏的组织学变化。
　　2.4 统计学处理实验结果均以(X±S)表示,采用统计软件SPSS 10.0中的ANOVA,Duncan"s test进行分析处理。
　　3结果
　　3.1 甘康对免疫性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响表1的结果表明,与正常组相比较,模型组血清中ALT,AST水平显著升高,甘康3个剂量组(200,400,800 mg・kg-1)和葵花护肝片(1000 mg・kg-1)组均能显著降低血清中升高的ALT,AST水平。
　　3.2甘康对免疫性肝损伤小鼠肝、脾指数的影响
　　表2的结果表明,与正常组相比较,模型组小鼠肝脾指数均显著升高,给予3个剂量的甘康(200,400,800mg・kg-1)和葵花护肝片(1000mg・kg-1)均能显著降低小鼠的肝指数,甘康和葵花护肝片对小鼠的脾指数无明显影响。
　　3.3甘康对免疫性肝损伤小鼠肝匀浆MDA,SOD,GSH-px水平的影响表3的结果表明,模型组肝匀浆MDA水平显著升高,同时SOD、GSH-px水平显著降低。给予不同剂量的甘康(200、400、800 mg・kg-1)均可显著降低肝匀浆中升高的MDA水平,甘康3个剂量组能提高肝匀浆GSH-px水平,甘康(400和800 mg・kg-1)能提高SOD酶活性,葵花护肝片可降低MDA水平,而对SOD和GSH-px水平无明显影响。
　　
　　3.4 甘康对免疫性肝损伤小鼠的肝脏病理的影响HE染色发现,模型组小鼠肝脏组织出现充血,炎细胞浸润、肝细胞出现胞浆嗜酸性变和胞核消失,呈现点状坏死、片状坏死、带状坏死等病变。甘康和葵花护肝片组肝细胞浊肿及嗜酸性变减轻、坏死灶减少、汇管区炎细胞浸润减轻。
　　4讨论
　　肝脏免疫性损伤的发病机制为:乙肝发病初期因外邪(病邪)强盛而致病,外邪主要为湿、热、毒。根据温病学说,三邪中以毒邪为主,清三邪以清毒为要。中医之毒应有外内之分,“外毒”为病原体(乙肝病毒),“内毒”则从免疫与病生理论理解。乙肝病毒除了对肝细胞有某种程度的病理性损伤外,更主要由感染后的宿主细胞产生一系列免疫反应造成的。急慢性肝细胞损伤程度不同,系机体对病毒抗原免疫应答的结果不同,这一看法已成为共识。免疫性损伤主要由三个方面:细胞介导的免疫损伤、免疫复合物免疫损伤、自身免疫反应引起免疫损伤。乙肝病毒(HBV)感染时对病毒作为抗原的免疫应答,与病毒消除和肝损伤机制同时相关。其中病毒感染短暂或持续,肝细胞损伤轻与重主要取决于CTL细胞应答的力度和广度。此外炎性细胞因子,自体活性损伤物质(Antacoids)如也积极参与肝损伤,它们相互诱导,共同作用。慢性乙肝的炎性反应同样激活中性粒细胞,在释放其它炎性介质的同时,释放出自由基O-2,NO等并生成具有强大的细胞毒性ONOO-。因此,中医所谓的内毒就是上述由乙肝病毒诱发出的进一步对肝细胞造成伤害的免疫细胞、细胞因子和自体活性损伤物质(Antacoids)等。
　　这个过程不是单向的而是有所受限的。除CTL细胞外也存在着Ts细胞,对前者有直接或间接抑制调节作用;同样在白介素家族中,尚有一些具有负性调节作用的细胞因子,如对巨噬细胞MФ活化起完全抑制作用的IL-10,IL-4,IL-13等,均可下调单核巨噬细胞炎性细胞因子和趋化因子的合成(包括IL-1,IL-6,IL-8,TNF-α等),抑制IL-1的活性,阻止IL-1α,IL-1β和TNF-α等诱导的内皮细胞活化等。机体这一双向调节生理机制为药物保护、减缓和治疗肝细胞的免疫性损伤提供了可能。
　　对此我们采取了(扶正驱邪)泄实补虚的治则:调理免疫功能,使之发挥清除病毒而减少对肝细胞的损伤;采取了清热解毒,疏肝理气,活血化瘀,滋补阴精的治法,坚持治肝与甘康统一,清毒和调理统一的思路。BCG加LPS诱导小鼠免疫性肝损伤模型的病理机制与人肝炎的免疫功能紊乱相似,是筛选和研究甘康药物较为理想的模型之一[1-2]。主要表现为单核细胞、枯否细胞在致炎因子的作用下,向肝脏聚集并被致敏。致敏的枯否细胞在接触LPS后,会释放某些细胞毒性介质,包括氧自由基等,从而造成肝细胞损伤。有关实验表明,丹参具有降低急、性肝损伤动物的血清转氨酶活力,促进肝细胞再生,抑制胶原纤维增生,减少肝细胞变性与坏死等作用[3];柴胡具有抗炎、解热、抗肝损伤、抗溃疡作用[4];甘草也具有肝保护作用[5]。
　　本研究表明,甘康(200、400和800 mg・kg-1)灌胃给药均能降低血清中升高的转氨酶水平,使升高的肝指数降低,但对脾指数无影响;但对T、B淋巴细胞的影响有待于进一步研究。同时发现甘康可降低肝匀浆MDA含量,使降低的肝匀浆GSH-Px、SOD活性升高,病理结果也显示能减轻肝脏的炎症坏死程度。提示该方剂具有肝保护作用,其机制与其抗氧化等有关,深入研究其作用可望将其开发出新的治疗肝损伤药物。
　　参考文献
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　　[3] 李武、沈志强、段丽芳.三七丹参对实验性肝纤维化的影响[J].现代医药卫生,2009,25(07)961-963.
　　[4] 杨洁、蔡刁龙、谭献,等.柴胡、红花、川芎中药单体对大鼠肝纤维化治疗作用的实验研究[J].临床盒实验医学杂志,2009, 8 (07):1-3.
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