压应力对增生性瘢痕成纤维细胞生长特性的影响_成纤维细胞名词解释

　　[摘要]目的：探讨不同持续时间压应力对人增生性瘢痕成纤维细胞生长特性的影响。方法：组织块培养法获取人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)，并随机将HSFb随机分为对照组(未施压)、持续施压组(25mmHg，6～8天)和施压(25mmHg，3～4天)后去除压应力组。分别以MTT法测定细胞生长抑制率、流式细胞仪测定细胞生长周期、免疫组化观察增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及Annexin-V-PI标记法测定细胞凋亡情况。结果：25mmHg持续压应力对HSFb的生长抑制率随加压时间的延长逐渐增大；与对照组相应时相点比较，PCNA表达降低，处于增殖期(S+G2+M)细胞比例减小；细胞凋亡率随施压时间延长逐渐增加；而施压后去除压应力继续培养观察显示，HSFb的抑制率逐渐回降，PCNA表达增加和增殖期细胞比例“反弹”增大，细胞的凋亡率也逐渐下降。结论：适当的持续压应力对人增生性瘢痕成纤维细胞具有抑制增殖与促进凋亡的共同效应，短期加压后去除压力致使上述效应“反弹性”降低，可能是临床上对增生性瘢痕压迫治疗需要早期、持续、长期维持的原因之一。
　　[关键词]机械压力；增生性瘢痕；成纤维细胞；增殖；凋亡
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）11-1545-06
　　
　　Effects of the Mechanical Stress on the characteristics of growth of human hypertrophic scar fibroblasts in vitro
　　XIAO Hong1，LI Jian-fu1，FU Xiao-bing2
　　(1.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Southwest Hospital,the Third Military Medical University,Chongqing 400038，China; 2.Institute for Basic Research,Trauma Center of Postgraduate Medical College,General Hospital of PLA,Beijing 100853)
　　
　　Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of mechanical stress on the growth characteristics of human hypertrophic scar fibroblasts(HSFb) in vitro.MethodsHuman hypertrophic scar fibroblasts obtained from the patient who suffered from hypertrophic scar in my hospital were isolated and cultured in vitro， and then they were randomly divided into 3 groups as follows：control group (no compression)，continuous compression group ( with 25 mmHg air pressure for 6-8 days ) and the cancelled stress after compressing group . The cellularproliferation was determined by MTT assay，cell cycle was detected on the flow cytometer，and PCNA expression in HSFb was confirmed by immunohistochemistry method. The apoptosis of scar fibroblasts was measured with Annexin V binding with PI labeling.ResultsBoth the inhibiting rate of HSFb growth and the apoptosis were markedly increase in continuous pressure group with loading time. Compared with control group，the PCNA expression and cell ratio within proliferative phase(S+G2+M) was decreased. However，the inhibiting ratio of HSFb growth，PCNA expression，cell ratio within proliferative phase and apoptosis ratio had gradually returned in the group of cancelled load after pressure.ConclusionBased on the above results，we suggested that combined effects of the proliferation inhibition and apoptosis promotion induced by continuous pressure in HSFb and the return of that combined effects after cancelling stress may potentially be one ofthe important reasons of well obtained therapeutic effect with pressure therapy for needing early stage and long time maintenance during the clinical practice.
　　Key words:mechanical stress;hypertrophic scar;fibroblasts;proliferation;apoptosis
　　
　　增生性瘢痕(hypertrophic scars，HS)严重影响机体外观和功能，其治疗目前尚缺乏有效手段。临床实践证明，压迫疗法的疗效与实施压迫的早晚和持续时间呈明显相关性，但其具体机制仍不是很确切[1]。越来越多的体外实验证据表明，张应力通过降低细胞凋亡与促进成纤维细胞合成丰富的细胞外基质而加速HS的形成[2-3]，但压应力则起到了相反的调控作用，从而抑制HS的生长[4-5]；我们前期研究也得到相似结果，为更深入探讨压应力对人增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblasts，HSFb)生长特性的影响及其机制，本研究选择25mmHg压应力作用于HSFb，进行压应力对其生长特性影响的实验观察。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 试剂与设备：DMEM培养基(Hyclone 公司)；HANK"S(Hyclone 公司)；PBS(迈新)；胎牛血清(Euroclone)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司)；二甲基亚砜(Amersco公司，美国)；胰蛋白酶(Sigma公司)；倒置相差显微镜(Olympus CK40)；酶联免疫检测仪(DG3022A型，华东电子管厂)；Annexin-V-PI试剂盒(JingMei)；PCNA试剂盒，DAB显色剂(迈新公司)；细胞加压装置(自行改装简易气控加压细胞培养仪，专利申请已公示，见图1)。
　　
　　1.2 增生性瘢痕的来源：增生性瘢痕组织取自2006年2月本院烧伤科患者(女性，20岁，全身大面积热烧伤愈合后3月，颈胸部形成大片瘢痕，取材部位为前胸壁，术后病理诊断为增生性瘢痕组织)手术后志愿捐赠。
　　1.3 方法
　　1.3.1 增生性瘢痕成纤维细胞的培养：采用组织块培养法。取新鲜瘢痕组织，去除表皮和皮下组织，在少量胎牛血清(FCS)中剪碎，组织块(0.5～3mm)接种于培养瓶，在体积分数为5%的CO2、37℃条件下培养4h，然后加入含体积分数为20%FCS的DMEM8ml，继续培养，每3天换液1次，待原代培养细胞生长融合成片，以2.5g/L胰蛋白酶消化，传代培养，取第4～8代细胞备用。
　　1.3.2 压应力对增生性瘢痕成纤维细胞形态的影响：将HSFb以每孔1×105个细胞分别接种于两块6孔培养板，均置入常规CO2培养箱12h贴壁后，一块以常规CO2培养箱培养细胞，一块移入简易气控加压细胞培养仪培养细胞，均培养4天后取出，倒置相差显微镜观察细胞形态。
　　1.3.3 压应力对增生性瘢痕成纤维细胞增殖活性的影响将HSFb以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，每孔体积200μl。以常规CO2培养箱分别培养2、4、6、8天后检测指标为对照组；细胞贴壁后移入简易气控加压细胞培养仪，施加压力大小为25mmHg，分别培养2、4、6、8天后检测指标为持续加压组；在上述压力下培养4天后改常规CO2培养箱再培养2、4天后检测指标为加压后去加压组。分别培养相应天数后，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光值(A)，检测波长为490nm。计算细胞生长抑制率(IR)=(1-施压组A值/对照组A值)×100%。
　　1.3.4 压应力对增生性瘢痕成纤维细胞周期及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响：分别将HSFb以每孔1×106、5×105个细胞接种于欲培养3天、6天的6孔培养板中。以常规CO2培养箱培养细胞，分别培养3天、6天后收集细胞或细胞爬片为对照组；12h贴壁后细胞移入简易气控加压细胞培养仪，施加压力大小为25mmHg，分别培养3天、6天后收集细胞或细胞爬片为持续加压组；在上述压力下培养3天后改常规CO2培养箱再培养3天后收集细胞或细胞爬片为加压后去加压组。
　　流式细胞仪测定细胞周期：分别收集上述细胞，调整其个数达1×106/ml。加冷PBS洗涤离心2次，70%冷乙醇4℃固定保存。PBS洗涤离心2次去除乙醇，加入PI染液(含PI 50μg/ml、Rnase 100μg/ml、Triton-X100 0.1%、柠檬酸钠1mg/ml、0.9%NS)，4℃避光染30min，200目尼龙网过滤，上机作FCM检测。采用488nm激发波长检测细胞核中PI荧光强度，打印DNA含量分布组方图，自动拟合细胞周期各时相比例。
　　免疫组化检测细胞PCNA表达情况：将上述细胞爬片按试剂盒说明书应用SABC法，DAB显色，苏木精复染。结果采用三级计分法统计分析结果，并取平均值。判断标准：根据染色强度，将结果分为3级，分别表示为淡黄色+、棕黄色++、棕褐色+++；根据阳性细胞数，计算每100个细胞中阳性细胞数，然后二者相乘，即为最后评分。理论上结果的范围为0～300分。
　　1.3.5 压应力对增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响：分别将HSFb以每孔1×106、7×105、5×105、3×105个细胞接种于欲培养2天、4天、6天、8天的6孔培养板中。以常规CO2培养箱分别培养2、4、6、8天后收集细胞检测指标为对照组；12h贴壁后细胞移入简易气控加压细胞培养仪，施加压力大小为25mmHg，分别培养2、4、6、8天为持续加压组；在上述压力下培养4天后改用常规CO2培养箱再培养2、4天检测指标为加压后去加压组。分别培养相应天数后收集细胞，调整其个数达1×106/ml。离心后重新悬浮于1ML的Annexin-V-FITC染色液。室温下染色5min，然后在细胞悬液中加入10μl的PI保存液，室温下染色5min上流式细胞仪检测。采用蓝色激发光(波长为488nm的亚离子激光)，绿色荧光检测范围为530nm左右，红色荧光检测范围：大于600nm，自动打印凋亡比例结果。
　　1.4 统计学处理：采用SPSS10.0统计软件分析，数据以均数±标准差表示，采用方差分析，P值＜0.05为有统计学意义。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 活体细胞倒置相差显微镜观察：显微镜下观察HSFb施加压力组与对照组均呈长梭形，大部分细胞可见向外伸出2～3个长短不一的突起，细胞的走行比较紊乱，方向性较差，形态特征无明显差别。培养相同的4天后，加压组较对照组细胞密度降低，见图2。
　　
　　2.2 压应力对增生性瘢痕成纤维细胞生物活性的影响：在对数生长期(2～6天)，压应力对HSFb的生长抑制率随持续时间的延长逐渐增大，非对数生长期(8天)抑制率无上述关系；施压后去除压应力组细胞抑制率较相应时相点持续压力组细胞减小，并随去压力时间延长较持续加压组减小幅度越大，见表1。
　　
　　2.3 压应力对增生性瘢痕成纤维细胞周期和增殖细胞核抗原(PCNA)的影响：持续加压组(3、6天)处于增殖期(S+G2+M)细胞比例、PCNA染色光密度积分较相应时相点对照组(3、6天)均明显减小，有显著性差异(P 　　
　　临床实践证明，应用压迫疗法治疗增生性瘢痕开始时间越早，治疗效果越好[9]，并且压迫时间达6个月以上，一般6～18个月，直到瘢痕成熟，变得白晰、柔软和平坦[10]，甚至有部分研究认为持续时间越长效果越好，其机制何在，既往报道较少。Cheng等[11]观察到，早期增生性瘢痕呈指数级增厚，1.5年后稳定，且在随后的2年里逐渐变薄，故建议在瘢痕形成后持续使用压应力治疗18～24个月，至少12个月。Costa等[12]研究认为：压应力是通过加速增生性瘢痕的成熟过程起作用。众所周知，增生性瘢痕是皮肤创伤愈合所导致的良性组织异常增生，组织学上以成纤维细胞增殖并分泌大量的细胞外基质为主要特征，而成熟期瘢痕则成纤维细胞及其分泌的基质明显减少。因此，从理论上，只要干预因素能阻止瘢痕成纤维细胞的增殖，降低其分泌细胞外基质的量，就会有疗效。本实验结果显示：在细胞对数生长期(2～6天)，25mmHg持续压应力对HSFb的抑制率随持续时间的延长逐渐增大，在非对数生长期(8天)无此效应； 25mmHg持续压应力导致HSFb核增殖抗原(PCNA)表达降低，处于增殖期(S+G2+M)细胞比例减小；施压一段时间后去除压应力，抑制率逐渐“反弹”，低于相应时相点的持续加压组，PCNA表达和处于增殖期细胞比例也“反弹”增加，均超过相应时相点持续加压组细胞。在细胞凋亡方面，于培养周期内，无论细胞是否处于对数生长期，未施压的对照组细胞凋亡率很低，并且随培养时间的延长凋亡率无明显变化；持续加压组细胞随施压时间延长凋亡率逐渐增加；加压4天后去除压应力的细胞，增高的凋亡率会逐渐“反弹”下降，明显低于持续加压组。结果提示，细胞处在对数生长期，压力对增殖的抑制效应随时间延长抑制效果越明显，而非对数生长期无此关系；短期施压后去处压力，对细胞增殖的抑制效应会逐渐“反弹”减弱。在细胞凋亡方面，无论细胞是否处在对数生长期，压力对凋亡的促进作用在一定时限内均逐渐增强；短期施压后去处压力，对凋亡的促进效应也会逐渐“反弹”减弱。 因此，可以认为：由于早期增生性瘢痕的增殖期细胞较中、晚期逐渐成熟的瘢痕比例高，压应力不仅对细胞增殖产生较大抑制作用，还对细胞凋亡有一定程度的促进作用，二者的复合效应导致瘢痕内功能细胞成份的减少，从而降低了胞外基质的沉积，可能是瘢痕治疗越早，防治效果越好的原因之一。增生性瘢痕后期处于增殖期细胞的比例相对减少，虽然压应力对细胞增殖的抑制作用相对减弱，但长期压应力使细胞的凋亡率持续在较高水平，因而也会对瘢痕产生抑制作用；而短期施压后停止施压，细胞的增殖率和凋亡率逐渐向相反方向“反弹”，从而导致短期压迫治疗容易失败，故而临床上压迫疗法治疗瘢痕需要早期、持续而长期施压。
　　然而，增生性瘢痕的构成不仅有大量增生性成纤维细胞，还有其大量分泌的基质。近年大量研究表明：应力对细胞基质的分泌产生巨大影响[13-14]，持续压应力对细胞基质分泌的影响是否是压应力治疗瘢痕疗效良好的原因有待进一步证实。另外，本文研究为体外环境，与拥有众多影响瘢痕形成的细胞因子[15-17]的体环境尚存在较大差异，因此，压应力对这两种环境中瘢痕成纤维细胞的影响是否相吻合，尚待深入研究。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Puzey G. The use of pressure garments on hypertrophic scars[J]. J Tissue Viability，2002，12(1) ：11-15.
　　[2]Aarabi S，Bhatt KA，Shi Y，et al. Mechanical load initiates hypertrophic scar formation through decreased cellular apoptosis[J]. FASEBJ，2007，21(12)：3250-3261.
　　[3]Eckes B，Zweers MC，Zhang ZG，et al. Mechanical tension and integrin alpha 2 beta 1 regulate fibroblast functions[J]. J Investig Dermatol Symp Proc，2006，11(1)：66-72.
　　[4]Renò F，Sabbatini M，Lombardi F，et al. In vitro mechanical compression induces apoptosis and regulates cytokines release in hypertrophic scars[J]. Wound Repair Regen，2003，11(5)：331-336.
　　[5]Yip CP，Walker D，Fernlund G，et al. Role of dermal fibroblasts in rat skin tissue biomechanics[J]. Biomed Mater Eng，2007，17(2)：109-117.
　　[6]Grymes RA，Sawyer C. A novel culture morphology resulting from applied mechanical strain[J]. In Vitro Dev Biol Anim，1977；33(5)：392.
　　[7]Acevedo AD，Bowser SS，et al. Morphological and proliferative responses of endothelial cells to hydrostatic pressure：role of fibroblast growth factor[J]. J Cell Physiol，1993,157：603-614.
　　[8]Sumpio BE，Widmann MD，et al. Increased ambient pressure stimulates proliferation and morphologic changes in cultured endothelial cells[J]. J Cell Physiol，1994,158：133-138.
　　[9]Pierce GF，Berg JV，Ruddph R，et al. Platelet derived growth factor-B Band transforming growth factor beta-1 selectively modulate glycosaminoglycans[J]. Am J Pathol，1991,138：629-646.
　　[10]胡永才，李晋江，欧才生. 弹力加压治疗烧伤瘢痕疗效评价[J]. 现代康复，2000, 4(1)：32-33.
　　[11]Cheng W，Saing H，Zhou H，et al. Ultrasound assessment of scald scars in Asian children receiving pressure garment therapy[J]. J Pediatr Surg，2001,36：466-469.
　　[12]Costa AM，Peyrol S，Porto LC，et al. Mechanical forces induce scar remodeling. Study in non-pressure-treated versus pressure-treated hypertrophic scars[J]. Am J Pathol，1999,155(5)：1671-1679.
　　[13]Chen J，Yan W，Setton LA. Static compression induces zonal-specific changes in gene expression for extracellular matrix and cytoskeletal proteins in intervertebral disc cells in vitro[J]. Matrix Biol，2004,22(7)：573-83.
　　[14]Waldman SD. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage[J]. Tissue Eng,2004,10(9-10)：1323-31.
　　[15]Colwell AS，Phan TT，Kong W，et al. Hypertrophic scar fibroblasts have increased connective tissue growth factor expression after transforming growth factor-beta stimulation[J]. Plast Reconstr Surg，2005，116(5)：1387-1390.
　　[16]厉 孟，张琳西，夏 炜，等. 质形成细胞源IL-1α对成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响[J].国美容医学，2006，15(12) ：1337-1339.
　　[17]王少华，曹广信，王燕华，等. 病理性瘢痕中结缔组织生长因子的免疫电镜观察[J] . 中国美容医学，2007，16(7) ：871-873.
　　
　　[收稿日期]2007-08-11[修回日期]2007-11-09
　　编辑/张惠娟