珊瑚石【珊瑚石人工骨中心性血管化的体内实验研究】

　　[摘要]目的:研究中心性血管化珊瑚石人工骨的血供和吸收情况,探索人工骨血管化的机理,为珊瑚石人工骨的临床应用提供更新的理论依据。方法:选取标准新西兰兔的股动脉埋植入预制珊瑚石人工骨隧道内,建立中心性血管化模型,分别植入骨膜下和皮下。以单纯珊瑚石人工骨同部位植入做对照。术后第1、2、4、8、12周行大体形态学和组织学检查,观察珊瑚石人工骨中心性血管化后的组织结构和血管新生情况并予定性分析。结果:中心性血管化珊瑚石人工骨各处均有大量血管新生,4～8周充满全层,12周血管化程度进一步增加。对照组仅少量血管自周围长入。结论:中心性血管化珊瑚石人工骨可大大提高人工骨的血管化水平,该模型有望成为珊瑚石人工骨的临床应用的新方式。
　　[关键词]中心性血管化;珊瑚石人工骨;成骨;吸收
　　[中图分类号]Q813.1R318[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)04-0537-03
　　
　　Experiment of central vascularized coralline in vivo
　　SU Ruo-wei, GUI Lai,ZHOU Xiao-dong,LIU Jian-feng,NIU Feng,YU Bing,ZHANG Yan-kun
　　(The 6th Department of Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College,Beijing 100144, China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo research the blood supply and absoption of the central vascularized coralline and explore the mechanism of vascularization in artificial bone for its further clinical application.MethodsTo determine whether the vascularization of coralline could be evaluated, we built the model by implanting the selected New Zealand Rabbits" femoral artery into the central tunnel of the coralline. We implanted the vascularied coralline into subperiosteum or subcutaneous, and also implanted the non-vascularized coralline as control. The animals were euthanized at 1w,2w,4w,8w and 12w post-operation. The morphology and histology of the implants were investigated.ResultsThe central vascularized corallines were filled with new-born vessels at 4～8w, and get further vascularized at 12w. To compare with,there were only a few new-born vessels in control.ConclusionThe vasculariztion of artificial bone graft could be evaluated by using this method. This model can probably be a new method for coralline in clinical use.
　　Key words:central vascularization;coralline;ossification;absorption
　　
　　目前珊瑚石人工骨已在颅颌面外科等领域得到较广泛的应用[1-3],而天然珊瑚石还存在降解速度较快的问题[4]。天然珊瑚石人工骨植入后,由于周围骨组织长入较缓,成骨量有限,降解过快则有可能出现骨不连接的情况。曾有学者以珊瑚石羟基磷灰石替代,因其不完全降解特性致骨组织替代缓慢,效果亦不甚佳。促进新生骨组织生长的前提在于充分的血供支持,研究发现,血管埋入能更好地保证血供,以更有效地发挥珊瑚石人工骨的骨传导作用,加速成骨细胞在腔管中的爬行。本研究即探索一种中心性血管植入的新方法,为构建内生性血管化珊瑚石人工骨提供理论基础。
　　1材料和方法
　　1.1 实验材料
　　1.1.1 珊瑚石:本研究选用的珊瑚石为中国海南岛周围海域采集的天然滨珊瑚石。
　　1.1.2 珊瑚石处理方法:珊瑚石去除表面杂物,清水洗净后自然晾干。切块置入5%次氯酸钠浸泡3次,每次5天,每次浸泡后均先清水冲洗后去离子水振荡冲洗24 h,充分去除孔隙结构内残留有机成分。置于80℃干燥箱内4h。后切割为10mm×8mm×8mm长方形珊瑚石人工骨块,骨块纵轴制作一直径3mm隧道后,纵向劈开骨块,形成有凹槽的两块对应骨块,常规高温高压蒸汽灭菌后备用(图1)。
　　1.2 实验动物:成年健康清洁级新西兰兔10只,体重2.5～3kg,雌雄不限。
　　1.3 实验方法
　　1.3.1 实验模型:第一模型:骨膜下植入中心性血管化珊瑚石人工骨,对侧骨膜下植入单纯珊瑚石人工骨对照;第二模型:皮下植入中心性血管化珊瑚石人工骨,对侧皮下植入单纯珊瑚石人工骨对照;第三模型:骨膜下植入中心性血管化珊瑚石人工骨,对侧皮下植入单纯珊瑚石人工骨对照。
　　1.3.2 模型建立方法:在全麻下常规消毒,作兔双侧后腿内侧自腹股沟中点至膝关节的纵形切口。解剖双侧股神经血管束,保护股神经,游离股动脉,分离出右后腿上1/3(A组)及左后腿下1/3(C组)股骨干骨膜下间隙;同时分离出左后腿上1/3(B组)及右后腿下1/3(D组)皮下间隙。将珊瑚石人工骨块分别置于A组骨膜下间隙处及B组皮下间隙处,将股动脉移入人工骨块中心隧道内,保持血流贯通,局部固定(图2),形成中心性血管化的A组和B组结果。同法,将单纯珊瑚石人工骨块置于C组骨膜下间隙及D组皮下间隙处并固定,不引入血管,形成C组和D组结果。
　　第一模型:A、C组组合;第二模型:B、D组组合;第三模型:A、B组组合。
　　三组模型均在同一个体上建立,可除去个体差异造成的误差。
　　1.3.3 模型分组:将10只成年健康清洁级新西兰兔随机分为5小组,每小组2只,混合喂养,上述方法建立模型,按术后第1、2、4、8、12周随机安乐处死2只动物并完成预计各项检查和研究。
　　1.4 观察指标和检测方法
　　1.4.1 大体观:比较植入前,观察珊瑚石人工骨吸收情况。
　　1.4.2 光镜下组织切片染色:定期取出目标位置组织块标本予固定、脱钙、包埋、切片、HE染色后,光镜下观察珊瑚石人工骨外层和中心结构中新生组织及血管的生长情况。
　　
　　2结果
　　所有动物均成活,无发热,切口无感染,一期愈合。动物活动正常,处死前植入物固定良好,无明显移植排斥反应,手术肢体无缺血坏死、活动受限及其他相关障碍。
　　2.1 大体观:珊瑚石人工骨植入后逐步出现纤维组织包绕、长方体边缘圆滑、表面浅弹坑样吸收,中心隧道管腔扩大等形态改变提示骨吸收。
　　2.1.1 第一模型:植入后除上述改变外可见新生肉芽组织生成,第4至12周植入物体积无明显变化,中心性隧道管腔进一步增宽。
　　2.1.2 第二模型:至第12周,B、D组植入物均已基本消失,提示B、D组植入物基本被吸收。与既往报道基本相似。比较第2、4、8周的结果来看,B组吸收速度较D组更快一些。
　　2.1.3 第三模型:随时间推移,A组植入块边缘较B吸收更多,提示A组植入块边缘吸收速度更快,中心隧道管腔未见明显区别。
　　2.2 光镜下组织切片染色:术后1周即出现周围毛细血管芽生长,随时间推移,新生血管延长增多,管壁逐步发展为多层复杂结构。
　　2.2.1 第一模型:A、C组植入物周围均有毛细血管芽生长,毛细血管内皮向人工骨内爬行,A组中心性血管有毛细血管肉芽向外生长。第2～4周,A组植入物内可见成簇散布单层有空毛细血管新生及成纤维细胞、成骨细胞出现,第4～8周新生毛细血管基本充满全层,珊瑚结构较松散,C组植入物仅周边部有毛细血管伸入。第8～12周,A组植入物内始出现多层复杂结构毛细血管壁,部分可见管腔,中央侧居多。珊瑚结构松散,有新生骨组织形成(图3)。第12周,A组植入物内毛细血管网结构已基本构成(图4),珊瑚结构未见。对比来看,A组珊瑚吸收速度及成骨速度均较C组快。
　　2.2.2 第二模型:B组可见中心性血管及周围的双向毛细血管芽生长。第2～4周,B组植入物内成簇散布有单层有孔毛细血管新生,第4～8周新生毛细血管基本充满全层,D组毛细血管仅存在周边部。第8周,B组植入物内始出现多层复杂结构毛细血管壁,管腔可见,中央侧居多。第12周,B组植入物内毛细血管网结构基本构成。
　　2.2.3 第三模型:A、B组植入物均有中央及周边毛细血管内皮爬入,且埋入的中心性血管结构无退化(图5)。周边部,A组较B组血管长入稍多,有成纤维细胞、成骨细胞爬行。第8周,A组珊瑚人工骨基本吸收,新生骨组织形成,而B组则仅成纤维细胞存在。另外,A组骨膜侧珊瑚吸收速度较B组稍快。
　　C组与D组的比较:二者毛细血管生长无明显区别,但C组可见植入物周边部(骨膜侧)少量新生骨组织,D组内未见,其血管化和珊瑚石人工骨吸收情况与既往报道基本相似[5]。
　　A、B两组中心性血管化珊瑚石人工骨模型,其新生血管化效率较单纯血管上皮组织自周围长入快。新生血管可见内膜、中膜、外膜等一般小血管结构,周围结缔组织成分支持,血管外时可见成骨细胞衬覆(图5),与骨折愈合时新生骨组织内血管结构相似,与正常骨组织中央管及穿通管内的小血管结构也基本相似。
　　
　　3讨论
　　3.1 珊瑚石人工骨是一种利用天然珊瑚石的三维多孔结构制成的人工骨替代材料,具有良好的生物降解性和生物相容性。其同时具有的良好的骨引导作用,能促进成骨细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞爬行长入;其生物降解性又能确保及时被吸收保证新骨组织良好生长。自1985年Souyris[6]等首先报道了两种天然珊瑚石人工骨的动物实验和临床应用及1988年Roux[7]报道珊瑚石人工骨在颅颌面外科中的初步应用以来,已有许多学者进行了相关的探索和研究,认为珊瑚石人工骨是一个极有发展潜力的骨缺损替代材料。珊瑚石的主要成分是碳酸钙,99%以文石的形式存在,其余1%为有机成分,主要为氨基酸[4-5]。近年来,珊瑚石临床应用存在的主要问题是其降解速度过快,可导致局部的骨不连接。针对这个问题,学者主要采用以下几个方向来解决:其一是寻找合适品种珊瑚石或改变天然珊瑚石/珊瑚羟基磷灰石比例来控制珊瑚石人工骨的降解速度,使其和成骨相符合;另一思路在于通过加快新骨组织生成来避免骨不连接情况发生的可能。
　　3.2 单纯珊瑚石人工骨植入后靠周围血液、组织液渗入和毛细血管爬入,仅能达支架内100～300μm[5]。如能在珊瑚石人工骨替代支架上实现更大程度的血管化,则能使成骨细胞、成纤维细胞更快长入,具有更好的营养供应,而形成多点生长的情况,使新骨组织生长速度加快,尽可能与珊瑚石人工骨降解速度相符,更快达到自身骨组织替代。Cassell总结生理和病理情况下的机体血管生长,提出了内生性血管化的概念,用于临床软组织修复[9]。毛天球等实验以环绕珊瑚石人工骨的血管束法应用于组织工程人工骨促进了骨组织再生修复[8]。其目的在于引入机体血管,提高人工骨内局部血管化水平,进一步诱导血管新生,以期达到多点新生肉芽血管生长。
　　3.3 就骨替代材料而言,无论是单纯的支架植入,还是组织工程骨,其新骨生成速度主要取决于种子细胞、生长养分、生长空间等因素的影响。这其中,人工骨组织血供情况是重要影响指标之一。虽然更大程度的血管化可能出现机体体液对骨替代支架的侵蚀吸收更加明显,但同时其亦可创造更加快速的血管肉芽组织新生,引导更加丰富的成纤维细胞、成骨细胞生长。是实现大块人工骨替代支架植入的关键问题。
　　3.4 本实验为珊瑚石人工骨中心性血管化的预实验。实验结果显示,中心性血管化珊瑚石人工骨在生理和结构上具有更好的血供和成骨效果,基本上达到了多点新生的要求,植入后的血管未见明显的退化,且新生的血管与正常骨组织新生及创伤后新生的血管无明显差异,证明中央性血管束引入珊瑚石人工骨营造的中心性血管化环境是完全可行且效果明显的。此法可待进一步研究,以明确中心性珊瑚石人工骨血管化的定量预期和效果,并作为一极具前途的血管化方案应用于珊瑚石人工骨,成为珊瑚石人工骨及其他以天然珊瑚石为支架的组织工程骨修补骨缺损的一个新思路。同时,此法亦可为各种珊瑚石人工骨降解吸收情况的定量标准化测定提供一个良好的组织模型,为珊瑚石人工骨的临床应用进一步提供理论基础。
　　
　　[参考文献]
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　　[2]Najib Ramzi,Geraldo Riheiro-Vaz,Edward Fomekong,et al. Long term outcome of anterior cervical discectomy and fusion using coral graft[J]. Acta Neurochir,2008, 150:1249-1256.
　　[3] Patel MM, Catalano LW 3rd. Bone graft substitutes: Current uses in hand surgery [J]. J Hand Surg Am,2009,34(3):555-556.
　　[4] 张智勇,宋业光,归来,等.自然珊瑚石人工骨的动物实验研究[J]. 中华整形外科杂志, 2000,16(1):60-61.
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　　[6]Souyris F, Pellequer C, Payrot C, et al. Coral, a new biomedical material: Experimental and first clinical investigations on Medreporaria [J].J Maxillofac Surg,1985,13(2): 64.
　　[7] Roux FX,Brasnu D,Loty B,et al. Madreporic coral: a new bone graft substitute for cranial surgery[J]. J Neurosurg,1988,69(4):510.
　　[8]杨镟凝,董青山,雷德林,等. 血管束法构建血管化组织工程骨支架材料的组织学观察[J].口腔颌面外科杂志,2009,19(1):5-8.
　　[9]Cassell OC,Hofer SO,Morrison WA,et a1. Vascularisation of tissue engineered grafts: the regulation of angiogenesis in reconstructive surgery and in disease states[J]. Br J Plast Surg,2002,55(2): 603-606.
　　
　　[收稿日期]2009-11-26 [修回日期]2010-03-16
　　编辑/张惠娟