脂肪来源干细胞的基础研究进展_打一针干细胞多少钱

　　2001年，ZuK等[1]研究发现并证实，抽脂术获得的脂肪组织中存在一群具有多向分化潜能的细胞，被称为脂肪来源干细胞(Adipose-Derived Stromal/Stem Cells，ASCs)。从此以后，ASCs开始逐渐被人们认识。ASCs取材容易、来源丰富，与骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived stromal/stem cells,BMSCs）一样具有自我更新能力、活力持久及多向分化潜能等干细胞特征，并且具有稳定生长和增殖、促进组织修复的能力。ASCs不仅在整形外科领域，如自体脂肪移植、促进创面愈合等，而且在心肌缺血、神经系统疾病、组织工程等领域中有着很好的应用前景，因此，关于ASCs的研究成为医学研究的热点之一，已经有部分的临床研究、基础研究持续不断深入，取得了较多的成果，本文就ASCs的基础研究进展综述如下。
　　1概述
　　ZuK等[1-2]以抽脂获得的人脂肪组织为研究对象，按照Katz等[3]的干细胞分离方法，获得了一个呈成纤维细胞形态的细胞群，体外培养时发现该细胞群具有稳定的倍增效应，能够向多种细胞分化，具有与干细胞所特有的多向分化潜能及自我复制能力，被称为脂肪来源干细胞(Adipose-Derived Stromal/Stem Cells，ASCs)。目前文献上主要是利用抽脂方式或者外科切除的脂肪组织进行胶原酶消化获得的细胞进行培养。ZuK等[1-2]的研究表明，经消化、离心、过滤分离的细胞接种4h后开始贴壁，24～48h内细胞生长处于停滞状态，形态呈小圆形，直径约5μm，色深。48h后，贴壁细胞开始伸展，呈成纤维细胞样短梭形，生长有方向性，直径增加至约20μm。5～6天后细胞呈集落样生长，有克隆形成。传代后细胞仍呈成纤维细胞样梭形生长。经过多次传代（l0～20代），细胞的增殖速度无明显减慢，表现出低衰老性。这表明脂肪组织蕴含丰富的ASCs细胞，Kotaro等[4]研究显示从抽脂术后抽吸物中提取的细胞至少有10%是ASCs，且细胞体外扩增能力很强，易于传代培养。
　　
　　2ASCs的鉴定
　　目前，尚无直接方法可鉴定ASCs。干细胞鉴定常用的鉴定方法都是通过分化表型逆推得知是否为干细胞[5]。ASCs在形态上与BMSCs相似，因此无法从形态学上与之鉴别[6]。研究证实多种干细胞皆可表达CD44。CD44表达为阳性，说明细胞来源于干细胞。在表型上，ASCs与BMSCs有共同之处，共同表达的有CD29，CD44，CD71，CD90，CD105，SH2，SH3；都不表达CD31，CD34，CD45。但ASCs肯定表达CD49，肯定不表达CD106；BMSCs肯定表达CD106，肯定不表达CD49。以上皆表明二者存在差别[7-9]。鉴定除分化表型外还要看是否具备干细胞的分化能力，目前文献上主要选择成脂和成骨分化鉴定。
　　
　　3多向分化潜能
　　3.1 向脂肪细胞分化：体外试验证明，ASCs能够回到原始分化途径，形成脂肪组织。经3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、胰岛素、地塞米松7～10天的诱导后，油红染色可发现ASCs中充满含有中性脂滴的小泡，能合成脂肪酸结合蛋白αP2和脂蛋白酶，并分泌脂蛋白瘦素[10]。在动物模型中注入已分化或未分化的ASCs，并配合不同的生物材料，如藻酸盐、透明质酸、纤维胶、多聚乳酸等，均能形成脂肪，而且使用多孔的生物材料能提高成脂肪的能力。
　　3.2 向成骨细胞分化：人ASCs在含有维生素C、β-甘油磷酸、1,25-二羟维生素D3的培养基中诱导2～4周，可在细胞外基质中形成磷酸盐钙化沉积物，并且表达骨源性基因和蛋白质(包括碱性磷酸酶、骨连接素和骨桥蛋白、成骨蛋白及骨钙素)。将ASCs包埋入由羟磷灰石/磷酸盐三钙构成的多孔的水立方体，植入免疫缺陷的小鼠体中，6周后可产生来自ASCs的新的骨样组织。相同的实验条件下，它可比BMSCs产生更多的骨祖细胞和细胞外钙化的基质成分[11]。
　　3.3 向软骨细胞分化：在培养基中加入转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子（IGF）、维生素C和地塞米松及转铁蛋白后，ASCs能显示出Ⅱ型胶原等与成熟软骨细胞相关的生化标志。使用合适的三维支架培养1～2周后的ASCs能分泌软骨细胞的细胞外基质蛋白和Ⅱ、Ⅵ型胶原和蛋白聚糖[12]。也有文献报道利用微团培养，组织学表现变得越来越像软骨，细胞间隙染色都是蛋白多糖[13-14]，在培养3周的时候，Ⅱ型和Ⅹ型胶原均上调。
　　3.4 向肌细胞分化
　　3.4.1 向骨骼肌细胞分化：在加入马血清的培养基中，ASCs能表达肌细胞生成素、肌原性调节蛋白(myoD)及骨骼肌转录调节因子。最终，细胞融合形成多核的肌管，并表达骨骼肌细胞谱系的标志蛋白，如肌球蛋白轻链激酶[15]。Gimble等[16]认为ASCs在骨骼肌损伤修复中很有应用前景。
　　3.4.2 向心肌细胞分化：培养基中加入5-氮杂胞苷诱导培养1周后，ASCs的形态发生改变,2周后细胞变成圆形，3周后细胞出现自发性搏动，并表达心肌细胞的特异性蛋白―肌钙蛋白I[17]。形态学、免疫组化和超微结构分析证明，这种分化的细胞有心室样和心房样细胞特性。有实验将ASCs注入鼠梗死心肌中,得到了较好的治疗效果[18]，相关动物心肌模型试验还需要进一步验证。
　　3.4.3 向平滑肌细胞分化：在体外培养中,发现ASCs表达α-平滑肌肌动蛋白，提示它有修复胃肠道或泌尿道平滑肌损伤的价值。Garcia等[19]移植自体同源的ASCs以修复直肠阴道瘘，并且观察到瘘管愈合良好,说明自体同源的ASCs可能成为极具价值的治疗方法。
　　此外，ASCs还被发现向其他细胞或胚层方向分化，例如可以向内皮细胞[20]、造血细胞[21]及神经细胞[22-23]等方向分化，并有报道称可以在一定的条件下向上皮细胞[24]、肝细胞[25]、胰岛细胞[26]方向转化。以上表明，ASCs具有多向分化潜能，在一定诱导条件下可向各个胚层细胞分化。
　　
　　4促进创面愈合和组织修复
　　成纤维细胞（Fibroblast,FB）是创面修复中起主要作用的细胞，通过增殖、迁移、合成和分泌细胞外基质等方式，参与肉芽组织及瘢痕形成和后期创面重塑。其中FB的增殖、迁移是创面愈合的两个重要因素。Kim[27]发现ASCs培养上清能够促进FB增殖,这个作用可能是通过ASCs在培养过程中产生的多种活性细胞因子实现的，如血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、b型成纤维细胞生长因子（bFGF）等。Kim等[28]还发现ASCs具有减少细胞损伤，减少FB凋亡的能力。 Kim, Lee等[27，29]研究发现，ASCs能够对FB的增殖迁移甚至胶原分泌等方面产生促进作用。另一方面，ASCs通过促进创伤部位血供的恢复来促进创面愈合。已经有不少关于ASCs可以促进慢性创面或者是急性创面愈合的文章，特别是对于放射性创面，效果很好。Lin等[30]研究表明，将ASCs移植到大鼠大脑局灶性缺血部位后，通过促进Bcl-2表达和抑制caspase-12来减少凋亡的发生，起到促进缺血组织存活和修复的作用,同样的实验结果在其他组织修复研究中也有发现。
　　
　　5 促进血管新生
　　Lu等[31]研究发现，ASCs具备促进血管新生的功能。Nakagami等[32]认为，ASCs促血管新生能力和BMSCs没有差别。ASCs能促进血管新生不仅是由于它具有分化为血管内皮细胞的潜能并进而参与血管构成。另外，它的分泌作用也在其中起到了重要的作用。Rehman等[33]的实验显示,在低氧环境中的ASCs，其VEGF的分泌量约为正常氧含量环境中的5倍；低氧环境中的ASCs上清能明显促进血管内皮细胞的生长和减少内皮细胞凋亡。Kim等[34]进行的干细胞向血管内皮分化的诱导实验发现，ASCs比BMSCs能够形成更多完整的管状结构。已经有关于ASCs促血管化治疗的文章了，这才是直接证据，ASCs对缺血组织器官的治疗将会是最具可行性的细胞治疗方案之一。
　　
　　6 免疫调节
　　ASCs具有调节固有免疫系统的能力，它们没有HLA-2类分子，比其他细胞免疫原性低。在同种异体造血组织移植小鼠中，将ASCs灌注到移植的造血组织中，成功地治愈了移植物抗宿主病（GVHD）[35]。关于人类的一些研究已经表明，将不相关的ASCs注入到受体中，ASCs具有抑制对供体细胞的免疫应答作用。这个结论不仅适用于造血移植物[36]，还适用于实体器官移植[37-38]（比如肝脏）。免疫调节效果很可能是T细胞依赖的效果，因为体内体外实验都表明，ASCs能够抑制活化T细胞的增殖活性[39-40]。即使是分化为其他细胞类型，比如骨细胞，体外实验也发现能有免疫下调的作用[41]。
　　
　　7潜在的威胁
　　任何一项新技术应用到临床之前，都需要详细地评估使用的安全性和可靠性。就ASCs而言，来源的多样性可能对治疗结果的均一性产生影响，使得对临床研究的结果不好分析和阐述。首先，ASCs在每个供体都不一样。性别不同也有区别[42]，最终导致分化的不同。研究表明，男性的ASCs更易分化成骨些，女性则是更易成脂。其他研究结果也表明，不同患者之间的成脂分化结果也是不同的[43]。年龄的增长也导致ASCs细胞群体的多样性，并且分化与增殖能力与年龄成反比例[44-45]。其次，ASCs提取时也存在差异，通过脂肪组织的直接切除可能与抽脂术不一样。另外，取材部位不一样，获得的细胞数量也不一样[46]。
　　 增殖和分化能力的不一致可能影响ASCs的临床应用，而且它的免疫抑制效果可能需要进一步的监测和警惕。因为BMSCs会向受伤部位募集并进展成组织化生和癌症[47]，而且能促进肿瘤生长[48]，同为间充质来源的ASCs也能向受伤部位趋化，所以也有可能对局部肿瘤形成起到促进作用。
　　
　　8结语及展望
　　总之，ASCs来源丰富，可进行自体移植，无免疫排斥反应，而且取材简便，不会像抽取骨髓那样，对患者造血系统与免疫系统造成一定损伤，是一类具有促进组织修复和替代特性的细胞。随着关于ASCs的研究不断深入，在研究临床应用的同时，要注意其潜在的危险性，相信ASCs的临床应用前景将会越来越好。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng,2001，7(2):211-228.
　　[2]Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell,2002，13(12):4279-4295.
　　[3]Katz AJ,Hull R,Hedrick MH,et a1.Emerging approaches to the tissue engineering of fat[J].Clin Plast Surg,1999，26(4):587-596.
　　[4]Kotaro Y,Hirotaka S,Hitomi E.Adipose-derived stem/progenitor cells:roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation[J].Regen.Med，2009，4(2):265-273.
　　[5]Pittenger MF,Mackay A,Beck S,et a1.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science，1999，284 (5411):l43-l47.
　　[6]Festy F,Hoareau L,Bes-Houtmann S.Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes[J]. Histochem Cell Biol，2005，124(2):113-121.
　　[7]Pilchard HL,Richerd WM,Klitzman B,et a1.Adult adipose-derived stem cell attachment to biomaterials[J].Biomaterials，2007，28(6):936-946.
　　[8]Lee PH,Kin B,Choi I.Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cell from human bone marrow adipose tissue[J].Cell Physiol Biochem，2004，14(46):311-324.
　　[9]Rodriguez AM,Elabd C,Amri EZ,et a1.The human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J]．Biochimie，2005，87(1):l25-128.
　　[10]Sen A,Lea-Currie YR,Sujkowski D,et a1.The adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous[J].J Cell Biochem,2001,81:312-319.
　　[11]Halvorsen YDC,Wilkison WO,Gimble JM.Adipose-derived stromal cells-their utility and potential in bone formation[J].Int J Obes Rel Metab Dis,2000,24:S41-S44.
　　[12]Erickson GR,Gimble JM,Franklin D,et a1.Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun,2002，290:763-769．
　　[13]Awad HA,Wickham MQ,Leddy HA,et al.Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells in agarose, alginate, and gelatin scaffolds[J].Biomaterials，2004，25:3211-3222.
　　[14]Guilak F,Awad HA,Fermor B,et al.Adipose-derived adult stem cells for cartilage tissue engineering[J]. Biorheology，2004，41:389-399.
　　[15]Mizuno H,Zuk PA,Zhu M,et a1.Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells[J].Plast Reconstr Surg,2002,109:199-209.
　　[16]Gimble JM,Grayson W,Guilak F,et al.Adipose tissue as a stem cell source for musculoskeletal regeneration[J].Front Biosci (Schol Ed)，2011，3:69-81.
　　[17]Rangappa S,Fen C,Lee EH,et a1.Transformation of adult mesenchymalstem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes[J].Ann Thorac Surg,2003,75:775-779.
　　[18]Zhang DZ,Gai LY,Liu HW,et a1.Transplantation of autologous adipose-derived stem cells ameliorates cardiac function in rabbits with myocardial infarction[J].Chin Med J,2007,120(4):300-307.
　　[19]Garcia-Olmol D,Garcia-Arranz M,Garcia LG,et a1.Autologous stem cell transplantation for treatment of rectovaginal fistula in perianal Crohn"s disease:a new cell-based therapy[J].Int J Colorectal Dis,2003,74:352-359．
　　[20]Colazzo F,Chester AH,Taylor PM,et al.Induction of mesenchymal to endothelial transformation of adipose-derived stem cells[J].J Heart Valve Dis，2010，19(6):736-744.
　　[21]Koc ON,Lazarus HM.Mesenchymal stem cells:heading into the clinic[J].Bone Marrow Transplant,2001,27:235-239.
　　[22]Ashjian PH,Elbarbary AS,Edmonds B,et al.In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitor[J].Plast Reconstr Surg，2003，111:1922-1931.
　　[23]Safford KM,Safford SD,Gimble JM,et a1.Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells[J].Exp Neurol,2004,187(2):319-328.
　　[24]Brzoska M,Geiger H,Gauer S,et a1.Epithelial differentiation of human adipose tissue-derived adult stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,330(1):142-150.
　　[25]Seo MJ,Suh SY，Bae YC,et al.Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,328(1):258-264.
　　[26]Timper K,Seboek D,Eberhardt M,et al.Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells differentiate into insulin, somatostatin, and glucagon expressing cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，341:1135-1140.
　　[27]Kim WS,Park BS,Sung JH,et a1.Wound healing effect of adipose-derived stem cells：a critical role of secretory factors on human dermal frbroblasts[J].Dermatolog Sci,2007,48(1):15-24．
　　[28]Won-Serk Kim,Byung-Soon Park,So-Hyun Park,et a1.Antiwrinkle effect of adipose-derived stem cell:activation of dermal fibroblast by secretory factors[J].J Dermat Sci,2009,53:96-102．
　　[29]Lee EY,Xia Y,Kim W S,et al.Hypoxia-enhanced wound-healing function of adipose-derived stem cells:increase in stem cell proliferation and up-regulation of VEGF and bFGF[J].Wound Repair Regen,2009,17(4):540-547.
　　[30]Lin XH,Liu N,Xiao YC,et al.Effects of adipose-derived stem cells transplantation on the neuronal apoptosis and the expression of Bcl-2 and caspase-12 in the brain post focal cerebral ischemia in rats[J].Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2011，27(1):40-43.
　　[31]Lu F,Mizuno H,Uysal AC,et a1.Improved viability of random pattern skin flaps through the use of adipose-derived stem cells[J].Plast Reconstr Surg,2008,121:50-58.
　　[32]Hironori Nakagami,Ryuichi Morishita,Kazuhisa Maeda,et a1.Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy[J].Ather Thromb,2006,l3(2):77-81.
　　[33]Rehman J,Traktuev D,Li J,et a1.Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells[J].Circulation,2004,109:1292-1298.
　　[34]Yeon Jeong Kim,Hoe Kyu Kim,Hyun Hwa Cho,et a1.Direct comparison of human mesenchymal stem cells derived from adipose tissues and bone marrow in mediating neovascularization in response to vascular ischemia[J].Cell Physiol Biochem,2007,20:867-876．
　　[35]Yanez R,Lamana ML,Garcia-Castro J,et al.Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have in vivo immunosuppressive properties applicable for the control of the graft-versus-host disease[J].Stem Cells,2006, 24:2582-2591.
　　[36]Fang B,Song Y,Liao L,et al.Favorable response to human adipose tissuederived mesenchymal stem cells in steroid-refractory acute graft-versus-host disease[J].Transplant Proc，2007，39:3358-3362.
　　[37]Fang B,Song Y,Lin Q,et al.Human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as salvage therapy for treatment of severe refractory acute graft-vs-host disease in two children[J]. Pediatr Transplant，2007，11:814-817.
　　[38]Wan CD,Cheng R,Wang HB,et al.Immunomodulatory effects of mesenchymal stem cells derived from adipose tissues in a rat orthotopic liver transplantation model[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2008，7:29-33.
　　[39]Wolbank S,Peterbauer A,Fahrner M,et al.Dose-dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane:a comparison with human mesenchymal stem cells from adipose tissue[J].Tissue Eng，2007，13:1173-1183.
　　[40]Puissant B,Barreau C,Bourin P,et al.Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells:comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Br J Haematol，2005，129:118-129.
　　[41]Niemeyer P,Kornacker M,Mehlhorn A,et al.Comparison of immunological properties of bone marrow stromal cells and adipose tissue-derived stem cells before and after osteogenic differentiation in vitro[J].Tissue Eng，2007，13:111-121.
　　[42]Aksu AE,Rubin JP,Dudas JR,et al.Role of gender and anatomical region on induction of osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells[J].Ann Plast Surg，2008，60:306-322.
　　[43]Sen A,Lea-Currie YR,Sujkowska D,et al.Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous[J].J Cell Biochem，2001，81:312-319.
　　[44]Lei L,Liao W,Sheng P,et al.Biological character of human adipose-derived adult stem cells and influence of donor age on cell replication in culture[J].Sci China C Life Sci，2007，50:320-328.
　　[45]Schipper BM,Marra KG,Zhang W,et al.Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells[J].Ann Plast Surg，2008，60:538-544.
　　[46]Fraser JK,Wulur I,Alfonso Z,et al.Differences in stem and progenitor cell yield in different subcutaneous adipose tissue depots[J].Cytotherapy，2007，9:459-467.
　　[47]Houghton JM,Stoicov C,Nomura S,et al.Gastric cancer originating from bone marrow-derived cells[J].Science，2004，306:1568-1571.
　　[48]Djouad F,Plence P,Bony C,et al.Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals[J].Blood，2003，102:3837-3844.
　　
　　[收稿日期]2010-11-29 [修回日期]2011-02-11
　　编辑/李阳利