脂肪组织工程研究进展_樱桃谷鸭粗脂肪需要研究进展

　　每年全世界有数百万例因创伤、肿瘤切除术和先天性缺陷导致的软组织缺损患者，需要通过手术进行修复重建。这些缺损常因脂肪组织缺失而导致正常组织形态改变和功能障碍。恢复缺损部位组织的功能，通常不是修复重建的主要目的，手术治疗的主要目的是恢复局部外形，使毁容所造成的心理创伤降到最低。目前的软组织重建常用方法包括各种组织瓣移植或人工合成替代物的植入，但目前尚无一种填充材料可以满足所有的临床需要。利用自体脂肪组织移植（游离移植或真皮脂肪瓣移植）修复软组织缺损的历史比较久远，也有不少临床应用的报告，但因游离移植的脂肪成活率低、容易吸收，真皮脂肪瓣移植操作复杂、不易塑形，效果并不十分理想。因此，应用组织工程学原理来构建脂肪组织已成为组织工程研究领域的热点之一。本文主要回顾脂肪组织工程的研究现状和新近的研究策略。
　　
　　1脂肪组织工程的基本原理
　　
　　脂肪组织工程即应用正常脂肪组织的活细胞，在体外进行大规模培养，并接种到三维结构的生物相容性支架上，然后将其从体外培养环境转移至体内，并能促进与受区细胞整合和血管长入；最终，该构造在支架降解过程中逐步被宿主的健康软组织取代。为使组织工程化脂肪成功地应用于临床上的软组织重建，必须处理好组织工程程序中所有的关键点，包括种子细胞和支架材料的选择、细胞培养的环境和转移方式。
　　1.1脂肪组织工程的细胞来源：成功地构建脂肪组织工程的第一步，是搞清楚脂肪形成过程，并确定一种适当的种子细胞。已有研究者采用前脂肪细胞(preadipocyte)和成熟脂肪细胞（Mature adipocyte）来修复组织缺损[1]，但通过吸脂获得的自体脂肪组织，在移植后由于不能尽快地重建血运而无法得到充足的血供，使组织难以长期存活，常常导致移植的脂肪组织被吸收。脂肪细胞胞浆内的脂质对吸脂操作的损伤十分敏感，大量细胞遭到破坏而无法保持期望的体积大小。另外，成熟的脂肪细胞在培养过程中处于分化终末期，其增殖能力有限，不能轻易地扩增，因此阻碍了它们在组织工程方法中的进一步应用[2]。
　　前脂肪细胞，是脂肪组织间质-血管成分中的前体细胞，这些细胞在分化前呈梭状或成纤维细胞样[3]。经分化后发生形态学和生物化学改变，变为圆形，并开始蓄积三酰基甘油，形成脂质空泡[4]。前脂肪细胞被认为是一种比成熟脂肪细胞更好的种子细胞，因为它们容易培养、扩增，而且容易获得，不仅能扩大增殖到更多的细胞数，而且能分化为成熟的脂肪细胞[5]。然而，前脂肪细胞经多次传代后，也会丧失分化能力[6]。
　　干细胞生物学的研究及应用也许能为脂肪组织工程提供一种理想的自体细胞来源。干细胞是一类具有自我更新与增殖分化能力的细胞，能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，同时还能分化为祖细胞。干细胞按其分化阶段的不同，可以分为胚胎干细胞（embryonic stem cell）和成体干细胞（adult stem cell）两类[7]。干细胞的应用能供给大量的细胞，如果成体干细胞的应用得以成功，那么就能利用患者自己的细胞构建组织，由此消除了其他来源细胞的排斥反应[2]。目前，利用干细胞产生脂肪组织的研究已经愈来愈受瞩目，来源于骨髓和脂肪组织的干细胞极有希望成为可供脂肪组织工程选择的种子细胞来源。
　　骨髓中含有的造血干细胞是现今被公认的间充质干细胞源。来源于骨髓的干细胞(BMSCs)存在于骨髓间质中，它们具有多能性，可分化为以下细胞谱系：脂肪细胞、骨细胞、肌细胞、肌腱细胞和神经细胞[8]。BMSCs一般是从骨髓移植供者身上抽取的骨髓中获得的，这种方法难免会给患者带来痛苦。骨髓干细胞经体外培养会呈现成纤维细胞样形态。有关骨髓基质干细胞的表面标记已经确定，这些标记可用于细胞选择和测定骨髓干细胞的数量[9]。骨髓干细胞除了具有分化为多重细胞谱系的能力外，还能为组织工程应用提供一个在体外相对容易分离和扩增的细胞源。通过移植一小块供体组织，就能使细胞数显著增加。Vashi等[10]用BM-MSC和普卢兰尼克F-127水凝胶制造了一个三维培养系统，试图在体外构建组织工程化脂肪。BM-MSC被分散在普卢兰尼克F-127水凝胶上，并加入I型胶原。两周后，在脂肪形成刺激素存在的条件下，BM-MSC分化为脂肪细胞。BM-MSC分化形成脂肪细胞，经油红O染色得到证实。
　　与骨髓来源间充质干细胞相比，脂肪组织来源干细胞（adipose derived stem cell ，ADSC）具有同等的分化为中胚层起源的细胞和组织的潜力，例如脂肪细胞、软骨、骨和骨骼肌[11]。ADSCs还显示出与骨髓来源干细胞非常相似的形态学表型[12]。除了它们共同的多能性，一些在骨髓干细胞表面发现的CD抗原标记，同样也能在ADSCs上发现[13]。 由于脂肪来源干细胞可从皮下脂肪组织中获得，并能很容易地被分离出来，在活体外和或体内都显示出快速地增殖并分化为成熟脂肪细胞的能力，为脂肪组织工程提供了一个光明的应用前景。然而，ADSCs的应用也有其局限性，目前认为ADSCs并不是万能的，它在体外大规模培养后也表现出明显的“衰老”迹象，由此限制了其移种能力。此外，脂肪组织在代谢活动中会发生改变，它的增殖和分化能力依赖于组织定位和患者的年龄及性别[13]。
　　近期，美国和日本的科学家研究出由人类体细胞诱导得来的多能干细胞（iPS）。他们的研究表明，用已确定的四种转录因子（OCT4、SOX2、NANOG和LIN28）能够将人体细胞改变为多能干细胞，这种细胞具有胚胎干细胞的基本特征。这些诱导形成的人类多能干细胞有正常的核型，表达端粒末端转移酶活性，表达人体胚胎干细胞的特征性细胞表面标记物和基因，并保持着内、中、外三个胚层所有的进一步分化衍生的发育潜能[14]。由于人体胚胎干细胞的来源牵涉到人类植入前胚胎的破坏，目前对胚胎干细胞的应用仍有伦理方面的争议；iPS不是来源于胚胎的细胞，因此消除了这一疑虑。这种人类诱导的多潜能细胞系将会对人体组织功能的研究和发展起到重要作用，同样也有可能应用到组织工程领域。但必须清楚地意识到，还需要进一步的研究以克服技术上的局限性（例如病毒整合引起的基因突变）。
　　1.2脂肪形成的分子调控：现已鉴定出一些在控制脂肪形成中起重要作用的转录因子，它们是CCAAT/强化因子结合蛋白基因家族和过氧化物酶活性增殖子γ-受体。还有激素和生长因子，例如胰岛素及胰岛素样生长因子（IGF），能传递外部信号刺激脂肪细胞分化，促进脂肪形成及血管发生[15]。向胎牛血清培养基中加入地塞米松、甲状腺激素或胰岛素等诱导剂，能使前脂肪细胞和干细胞的体外分化得到加强。进一步在分子水平上了解脂肪形成的机制，将有助于构建组织工程化脂肪并促进脂肪组织再生。
　　1.3 脂肪组织工程的支架材料：支架材料在组织工程组织的构建中占有举足轻重的地位。理想的三维支架应具有临时细胞外基质（ECM）的作用，为脂肪组织工程种子细胞提供附着、增殖、分化和营养代谢的场所。细胞以其附着的三维支架为模板，发展形成新的脂肪组织。现已研究出许多应用于脂肪组织工程的不同种类的人工合成支架材料，包括聚乙醇酸（PGA）、聚对苯二甲酸乙酯（PET）、多聚共乳乙交酯酸（PLGA）和聚四氟乙烯（PTEF）。天然衍生材料，例如胶原，透明质酸衍生物，基质胶和纤维蛋白等也已得到研究。在设计支架的时候，有许多因素值得考虑，包括支架的机械性能、降解特性、免疫原性、细胞对材料的反应性，在临床应用中是否易于操作并能减少成本[16]。理想的材料修饰是将生物活性成分与支架材料结合，使支架成为一个生物分子控释系统，以使生物活性分子的释放持续于支架降解全过程。这些加工技术的改进，使脂肪组织工程的支架材料有可能与细胞粘附分子、趋化因子和生长因子结合，系统地调控脂肪干细胞的粘附、分化、增殖和代谢功能，从而促进组织工程化脂肪的形成。最近纳米级结构材料的发展与分子生物学研究结果的结合[17]，可使生物活性分子在材料中有序组装，将对组织工程发展产生深远影响。
　　
　　2脂肪组织工程研究策略及其进展
　　
　　现在已有许多构建脂肪组织的策略。这些策略通常是将前脂肪细胞播种在由可被吸收的聚酯、透明质酸、胶原、聚乙二醇（PEG）和化学改性藻酸盐等材料构成的聚合物支架上。应用于脂肪组织工程研究中的支架形状各不相同，比如聚合物盘、海绵、泡沫和可注射的微球[2]。传统的脂肪组织工程策略，是从患者身上吸取或切除的脂肪组织中获得前脂肪细胞和毛细血管内皮细胞，并通过酶消化作用将它们分离出来。把前脂肪细胞与适当的生长因子一起培养在多聚体支架上，然后将该支架植入到患者软组织缺损处。理想的结果是随着支架改型或吸收，前脂肪细胞会不断生长、增殖，并最终发育成熟为脂肪组织。Patrick等[18]应用这种方法证明了前脂肪细胞具有分化成为成熟脂肪细胞的能力，而细胞在PLG支架上的生长状况说明前脂肪细胞经移植后具有长期的存活力。脂肪细胞的产生可通过组织学染色和荧光标记方法进行鉴定。这一基本的脂肪组织工程策略主要以前脂肪细胞的应用为重点，而忽视了用来构造支架的材料方面的问题。
　　后来的研究对材料进行了修饰，使之尽可能地增强细胞的粘附增殖及生物相容性。Hemmrich等[19]比较了装载有前脂肪细胞的透明质酸和胶原这两种生物材料对于脂肪组织工程的适用性。结果证明该方法能够使脂肪组织在活体内重新形成，但是支架孔径的大小和稳定性是限制细胞在其构造中充分分布的客观因素。他们在后面的研究中制作了一个新的可降解基质：聚酯衍生的非针织物。这种材料是应用纺织制造业中的空气动力学网状物形成方法和针毯技术而制成的，它是以己内酰胺、已二酸和1,4-丁二醇为基础的三维结构。把人的前脂肪细胞播种到该支架上，并对细胞增殖分化进行检测，结果显示聚酯材料允许前脂肪细胞很好的粘着、增殖和分化。这些研究对于设计一种能使细胞相互作用最佳化的支架具有指导作用。由于脂肪来源干细胞（ADSC）能较好地经受住来自抽吸套管的机械性损伤，移植后具有良好的细胞存活力并能再生新的脂肪组织，Rubin等[20]用多孔的胶原微球作为细胞载体来培养和移植ADSCs，经过试验证明该策略是可行的。这一策略将ADSCs在体外诱导分化，然后将细胞和支架精确地置入组织床内，观察干细胞在这些微球内增殖和分化的能力。研究者从人脂肪组织中分离出脂肪来源干细胞并置于微球上，在搅动生物反应器内进行培养。培养几周后，细胞在微球上附着、增殖并保持高度活力。结果发现胶原微球对脂肪来源干细胞是一种良好的支架，能够使细胞在颗粒上进行体外增殖和分化，并且这些微球颗粒小到能以注射的方式植入到组织缺损部位。
　　另一个新颖的研究策略是完全以细胞为基础的重建方法。Melanie Vermette等[21]利用适当的“自组装”培养方法学，试图创造一个新的、完全自体来源的组织工程脂肪替代物。他们应用来源于抽吸或切除下来的脂肪中的间充质干细胞进行体外培养，在脂肪细胞分化发生的过程中，添加维生素C，从而刺激间质细胞自己产生细胞外基质（ECM）。有功能的脂肪细胞长入到自身分泌的ECM支架内，形成一个天然的“生物材料”。经扫描电镜观察，这些重建的脂肪组织的形态与皮下脂肪十分相似，而且能分泌脂肪动员因子并发挥β-肾上腺素刺激性受体介导的脂解作用，具有白色脂肪组织主要的生物学功能。因此，这种以细胞为基础的组织工程策略，能够产生一种有功能的完全天然的脂肪组织，为特定的体外和自体软组织重建提供应用可能。
　　
　　3脂肪组织工程的临床应用和展望
　　
　　尽管众多学者进行了大量的研究工作，组织工程化脂肪替代物由于种种原因尚未能应用于临床，这表明需要进一步优化目前的支架模型并改革创新构建这种特殊类型组织的策略。目前干细胞在组织工程中的应用是研究的热点，有许多相关的问题需要解决，包括组织获得方法的标准化、细胞分离和培养。直到今天，没有发现一种确定的成体干细胞标记，可以保证所有干细胞群的纯净[22-23]。缺乏这样的标记，有可能使干细胞的应用存在变异性。但无论如何，干细胞在脂肪组织工程的研究中已显示出了良好的应用前景，干细胞接受适当刺激后有分化为内皮细胞和脂肪细胞的能力，将有利于形成一个血管化的脂肪移植物，为应用组织工程脂肪组织进行软组织重建带来了希望。
　　
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　　[收稿日期]2008-03-02 [修回日期]2008-05-25
　　编辑/李阳利