【５９５ｎｍ激光对兔耳瘢痕成纤维细胞增殖与凋亡的影响】成纤维细胞名词解释

　　[摘要]目的：探讨595nmVbeam激光照射对增生性瘢痕动物模型伤口愈合过程中成纤维细胞增殖与凋亡的影响。方法：成年大耳白兔20只，建立兔耳腹侧面增生性瘢痕模型，对比研究在瘢痕形成过程中595tlmVbeam激光照射对兔耳瘢痕成纤维细胞的影响，采用免覆组化方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达和细胞凋亡的原位检测。结果：兔耳增生性瘢痕经595nmVbeam激光照射后，按不同时间段取材进行免疫组化染色并与对照组比较，高倍镜下观察结果，显示PCNA蛋白表达明显减弱，细胞凋亡增加。结论：595nmVbeam激光照射可抑制兔耳增生性瘢痕成纤维细胞的增殖过程，诱导细胞凋亡。应用595nmVbeam激光预防和治疗瘢痕是可行的。
　　[关键词]vbeam激光；增生性瘢痕；成纤维细胞；免耳瘢痕模型；细胞凋亡
　　瘢痕形成是美容医学临床上的一个常见问题，是烧伤或手术等创伤后常见的并发症，但目前没有一种治疗可以从根本上阻止瘢痕的发生或者获得令人满意的疗效。Vbeam激光是一种波长为595nm的脉冲染料激光，近年来脉冲染料激光应用于临床治疗各种血管性病变的同时，发现其对瘢痕有一定作用。本实验通过应用兔耳瘢痕模型为实验对象，观察595nmVbeam激光对增生性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的影响，探讨其对增生性瘢痕治疗作用的机制，为应用于临床预防和治疗增生性瘢痕提供理论和实验依据。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　实验动物：日本大耳白兔20只，雌雄不限，体重1.5～2.0kg，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。
　　
　　1．2　主要试剂：Ⅰ抗鼠抗兔PCNA单克隆抗体、Ⅱ抗羊抗鼠IgG抗体-HRP多聚体、DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。细胞凋亡原位检测试剂盒购于罗氏公司。
　　
　　1．3　主要仪器设备：595nm Vbeam激光血管治疗仪(美国CANDELA公司生产)；OLYMPUS光学显微镜。
　　
　　1．4　建立动物模型：将大耳白兔分笼饲养2天后，按文献报道方法建立增生性瘢痕动物模型，即在3％戊巴比妥那麻醉下，用圆形钻刀在每只兔耳腹侧诬沿长轴避开血管，各做4个直径6mm的圆形全层皮肤缺损创面，深达软骨表面，每个创面间隔2cm以上，共做160个。术后常规抗感染，自由进食。术后21天，160个创面中有103个创面愈合突出于皮肤表面，即形成增生性瘢痕。
　　
　　1．5　实验分组：创面上皮化后切取一组增生性瘢痕8处(A组)，然后将形成的增生性瘢痕随机分为两组，分别为激光治疗组和对照组。激光治疗组在创面上皮化后开始进行激光照射，采用Vbeam激光血管治疗仪，波长595nm，本组采用的治疗参数是光斑直径7mm，发射频率1.5Hz，脉宽1.5～6ms，能量密度7～11J／cm，动态冷却发射时间和间隔时间均为30ms。开始时每周照射一次，一个月后改为每两周照射一次，共两个月。对照组不进行治疗。
　　
　　
　　1．6　标本取材及处理：在上皮化后1、2、4、6、8周分别切除两组增生性瘢痕各8处(B，c，D，E，F组)，加上上皮化后切取的一组瘢痕，共计取材88处。各组组织均4％多聚甲醛固定48h后常规脱水，石蜡包埋，拟行PCNA蛋白测定和细胞凋亡的原位检测。
　　
　　1．7　观察指标
　　1．7．1 PCNA蛋白测定：应用常规2步免疫组化法，按试剂盒说明书操作。以PBS代替一抗作为阴性对照，细胞核内含有棕黄色颗粒者为阳性细胞。在400倍光镜下观察结果，每张切片找5个阳性细胞最多的视野进行计数，阳性细胞反应率(％)=阳性细胞数／细胞总数×100％，结果取均数。
　　1．7．2　细胞凋亡的原位检测：采用TUNEL法，按步骤操作。细胞核内含有淡棕黄色至深棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。400倍光镜下观察结果，随机选择3个阳性细胞最多的高倍视野进行计数，死亡率以凋亡细胞／细胞总数×100％表示，结果取均数。
　　
　　1．8　统计学分析：每组样本数据用均数±标准差即(x±s)表示，采用SPSS软件进行统计学处理，使用配对t检验，以P＜0.05为有显著性差异。
　　
　　2　结果
　　
　　纳入实验大耳白兔20只，实验中无脱落，均进入结果分析。
　　
　　2．1　PCNA检测：可见表皮基底细胞层，棘细胞层，颗粒层和大量真皮成纤维细胞及真皮血管内皮细胞较多增殖细胞核抗原阳性表达。上皮化后增殖细胞核抗原阳性细胞反应率为18.33％，以后随时间推移逐渐增高，至上皮化后4周达高峰。从上皮化后1周开始可见激光治疗组增殖细胞核抗原蛋白表达较对照组减弱，经统计学处理，两组差异具有极显著性(P＜0.01)，具体见表1。上皮化后4周，对照组增殖细胞核抗原表达，激光治疗组增殖细胞核抗原表达减弱。
　　
　　2．2　细胞凋亡原位检测结果：在成纤维细胞和血管内皮中可见凋亡小体，即凋亡细胞。在瘢痕形成的早期，仅有少量阳性细胞，随时间推移凋亡细胞逐渐增加，在上皮化4周时凋亡细胞较前明显增多，真皮中见较多凋亡的成纤维细胞，而到了上皮化6周时才达到凋亡高峰，至上皮化8周时凋亡指数仍然持续很高。从上皮化后4周开始，两组瘢痕凋亡率有极显著性差异，P＜0.01，上皮化后6周时对照组凋亡细胞，激光治疗组凋亡细胞增多。
　　
　　3　讨论
　　
　　创伤修复过程中，由于全身和局部因素的影响，常可导致细胞外基质(ECM)过度沉积和胶原降解减少而形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩，病理表现为成纤维细胞的大量增殖和胶原的过度沉积。而且在不同的形成阶段有着不同的临床表现和发展趋势，不仅严重影响外貌和功能，也会造成患者心理的异常。目前对于增生性瘢痕的治疗方法很多，用于防治瘢痕的药物研究也非常多，但人们对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩形成的原因尚不完全明了，临床疗效还不尽如人意。
　　激光治疗增生性瘢痕始于20世纪70年代后期。激光治疗瘢痕的原理是利用激光的烧灼、气化、切割、凝固及散焦等特有作用，去除瘢痕组织或损伤瘢痕内血管、抑制胶原合成和细胞增殖及诱导细胞凋亡。应用脉冲染料激光治疗瘢痕始于20世纪90年代初期，原理在于其能特异作用于微血管。1994年Alster报道了应用585nm闪光灯泵浦染料激光治疗静止期红斑性增生性瘢痕，经皮肤纹理分析和临床观察等研究证实1到2次治疗就有明显改善。Vbeam激光血管治疗仪也是一种脉冲染料激光，波长为595nm，由于其波长更长，对组织的穿透也更深。其脉宽具有可调性，有1.5ms、6ms、lOms、20ms、30ms、40ms，可根据不同病变适当选择，超长脉宽使组织有更长时间吸收激光能量，得到温和加热和均匀凝结，会取得更好的治疗效果。另外该激光仪还配有动态冷却系统，既能有效降低激光热效 应对皮肤的损害又能减轻病人的疼痛，在治疗血管性疾病中起到良好效果。应用脉冲染料激光治疗瘢痕的原理在于抑制小血管的形成并闭合小的血管，来加重瘢痕缺氧程度并减少生长因子及成纤维细胞来源，从而预防并治疗瘢痕。由于增生性瘢痕早期含有大量毛细血管，微循环灌注过度，瘢痕外表呈鲜红色。激光通过其光热溶解作用，破坏组织细胞，使毛细血管丛凝固，组织缺血缺氧，乳酸代谢增加，pH值降低，颗粒细胞溶解后脱颗粒释放胶原酶；血流减少后巨球蛋白含量下降，可间接增强胶原酶活性，胶原分解增加。另外激光的高热溶解作用可使胶原骨架断裂，促进胶原结构重建，瘢痕变软，体积变小。
　　成纤维细胞增殖活性在增生性瘢痕的发生发展中起到重要作用。而其增殖活性又分为增殖分化功能和细胞外基质的合成分泌功能。增殖细胞核抗原PCNA是一种细胞周期调节蛋白，在DNA复制过程中起重要作用。PCNA的表达已证实与细胞的增殖状态密切相关。细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，是由基因控制的、细胞自主的、有序的死亡过程。细胞凋亡不仅参与正常创伤愈合的组织重建，而且在增生性瘢痕的形成、消退过程中亦扮演十分重要的角色。当某些原因导致增生性瘢痕组织中的细胞凋亡数减少，则阻碍增生性瘢痕成熟；相反，若通过某种物理的或化学的手段来诱导或促进瘢痕组织中的细胞凋亡，则加快增生性瘢痕的消退。脉冲染料激光对血管的作用已经得到证实，而其对成纤维细胞增殖与凋亡活性的作用还鲜有报道。因此本实验用脉冲染料激光作用于兔耳增生性瘢痕，通过与对照组比较增殖细胞核抗原蛋白表达和细胞凋亡的变化来确定595nm Vbeam脉冲染料激光对兔耳增生性瘢痕形成过程的影响，证实其对增生性瘢痕的预防及治疗作用。经免疫组化分析证实增殖细胞核抗原PCNA表达从上皮化后开始逐渐增加，至上皮化后4周达高峰。经595nm Vbeam脉冲染料激光照射后，激光治疗组增殖细胞核抗原PCNA表达从上皮化后1周开始同对照组比较可见明显减弱，提示成纤维细胞的增殖活性降低。TUNEL技术检测细胞凋亡率显示在兔耳伤口上皮化后仅有少量凋亡细胞，在上皮化后4周时凋亡细胞有所增加，而凋亡高峰在上皮化后6～8周才出现。经595nm Vbeam脉冲染料激光照射后，治疗组在上皮化后4周起凋亡率与对照组比较就有明显增加。本实验结果显示，在增生性瘢痕形成过程中应用Vbeam脉冲染料激光照射，可抑制成纤维细胞增殖活性，诱导细胞凋亡，减轻兔耳瘢痕增生程度，从而验证了Vbeam激光照射对兔耳增生性瘢痕具有预防和治疗作用。而且这种新型激光利用瞬间的高能量作用，既消除病变又不造成周围组织的烧伤，还能使胶原纤维平顺紧密，可以产生美容效果。但其对于人类增生性瘢痕的作用还有待于进一步的研究。