[表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对小鼠脱发模型毛发生长的影响] 表没食子儿茶素没食子酸酯

　　[摘要]目的:观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对C57BL6小鼠脱发模型毛发生长及毛发周期的影响。方法:采用松香、蜡脱毛法诱导小鼠体毛由休止期进入生长期。脱毛次日分组,各组小鼠每日分别以8%EGCG乙醇制剂、5%米诺地尔溶液、乙醇涂擦脱毛区,连续21天,记录小鼠皮肤颜色变化过程及新生毛发生长状况,并通过HE切片观察EGCG对皮肤、毛囊形态,毛囊数目的影响。结果:与阴性对照组相比,实验组和阳性对照组提前24h由粉红变为红色、推迟48h由黑色变为灰色,而基质组与阴性对照组无明显差别;实验组和阳性对照组小鼠毛囊数目在统计学上均与阴性对照组小鼠具有显著性差异。结论:EGCG可诱导小鼠毛囊进入生长期,延长生长期时间,推迟进入退行期,并刺激小鼠毛囊数目增多。
　　[关键词]EGCG;C57BL6小鼠;毛发周期;毛囊
　　[中图分类号]R758.71[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)03-0350-03
　　
　　Effects of EGCG on hair growth of C57BL6 mouse alopecia model
　　LI Da-ning,LI Mei-yun,LIU Jin-fen,FENG Xin-qing,SHI Yu
　　(Dermatology Department of Xuhui Central Hospital, Shanghai200031,China)
　　
　　AbstractObjectiveTo observe the effects of EGCG on hair growth and hair cycle of C57BL6 mouse alopecia model.MethodsWe induced back hair of mice from anagen to telogen by depilation of hair shafts with wax∶resin (1∶1) mixture. The mice were treated tropically once a day respectively using 8% EGCG, 5% minoxidil solution and alcohol for 21 days, meanwhile the changes of skin color and new hair growth characteristic were observed daily. Furthermore,the effects of EGCG on skin, hair follicle morphology and the number of hair follicles were evaluated by HE slice.ResultsCompared with the negative control group, the back skin color of the experimental group and the positive control group turned from pink to black 24h earlier and gray from black delay 48h, while the matrix liquid group and the negative control group have no significant differences. There are significant differences in experimental group, the positive control group and the negative control group on the number of hair follicles.ConclusionEGCG not only can induce and prolong anagen, but also postpone catagen in C57BL6 mice. Moreover, EGCG can stimulate an increase in the number of hair follicles in mice.
　　Key words: EGCG; C57BL6 mice; hair cycle; follicles
　　
　　表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是绿茶提取物茶多酚中的一种主要活性单体,具有广泛的生物学活性。为了探讨EGCG与毛发生长的关系,笔者以C57BL6小鼠作为动物模型,观察EGCG对小鼠脱发模型毛发生长及毛发周期的影响。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验动物:C57BL 6 小鼠,雌性,8 周,15～20g,同系,共24只,中国科学院药物研究所动物中心提供。选择皮色粉红,毛发属于休止期的小鼠。C57BL6小鼠的毛发周期同步,可根据其皮肤颜色判断毛发周期的阶段变化,毛发生长期皮肤呈黑色,退行期呈灰色,休止期呈粉红色[1]。
　　1.1.2 主要试剂:EGCG购于美国Sigma公司,货号E4143;5%米诺地尔溶液(商品名:蔓迪)。
　　1.2 方法
　　1.2.1 小鼠脱发模型建立:将松香与石蜡1:1混合加热融化后,均匀涂于小鼠背部,涂抹面积约2cm×3cm,冷却凝固后揭去,以去除背毛。确认毛发生长期处于休止期。
　　1.2.2 动物分组:脱毛次日,选取脱毛区光滑无皮肤破损的小鼠,随机分为4组,每组动物数6只。分别是:①实验组:给予8%EGCG乙醇制剂;②阳性对照组:给予5%米诺地尔溶液;③基质组:给予基质液(乙醇);④阴性对照组:不涂抹药物。
　　1.2.3 给药:局部皮肤直接用棉签涂抹给药,每天定时给药1次,每次给药量为0.1ml,连续给药20天。
　　1.2.4 观察记录结果:每天观察小鼠皮肤及毛色变化,记录每只动物背部去毛区皮肤颜色从涂药到开始变黑的时间;阴性对照组记录脱毛后第1天到开始去毛区皮肤变黑的时间;去毛区开始变黑到长满毛的时间,并定期拍照。
　　第4、12、20天时,取各组小鼠背部相同位置皮肤组织块,用10%福尔马林固定,石蜡包埋切片,切片厚约4～5μm,HE染色,光镜下观察。观察指标如下:①一般组织学检查:观察皮肤完整性,有无充血、水肿、炎细胞浸润等反应及程度;②毛囊计数,每例数3个高倍视野(×400)的毛囊数,取其均值,并进行统计学处理。
　　1.2.5 统计学分析:采用SPSS.11统计软件进行两样本均数的t检验。
　　2结果
　　2.1 EGCG对毛发生长周期的影响:①实验组小鼠在拔毛后第5～6天局部皮肤逐渐出现黑色,毛发进入生长期,10天后新的毛发长出,20天时皮肤颜色又经灰色(退行期)变为粉红色(休止期),皮肤黑色及灰色共持续约15天;②阳性对照组小鼠在拔毛后第5天局部皮肤渐出现黑色,毛发进入生长期,9天后新的毛发长出,20天时皮肤颜色又经灰色(退行期)变为粉红色(休止期),皮肤黑色及灰色共持续15天;③基质组、阴性对照组小鼠均在拔毛后第6天局部皮肤由粉红色变为黑色,10天后新的毛发长出,19天时皮肤颜色又经灰色变为粉红色,皮肤黑色及灰色共持续13天。
　　2.2 组织学检查
　　2.2.1 实验第4天时,切取每组小鼠背部皮肤,可观察到实验组和阳性对照组皮下血管网丰富,血管较粗;而基质组和阴性对照组未见此现象,见图1。
　　2.2.2 实验第12、20天,切取每组小鼠背部皮肤,石蜡切片,HE染色观察到:各组小鼠皮肤结构均完整,被覆鳞状上皮完整,角化层无增厚,真皮内无炎细胞浸润。实验组和阳性对照组动物皮肤毛囊发育较完整,数量较多,黑素较基质组和阴性对照组明显。各组毛囊形态无明显差异,见图2。
　　2.3 EGCG对毛囊密度的影响:实验第20天,各组小鼠毛囊数目见表1。实验组、阳性对照组与阴性对照组小鼠在统计学上均具有极显著性差异,P0.05。且实验组与阳性对照组相比较无显著性差异,P>0.05。
　　3讨论
　　EGCG是绿茶提取物茶多酚中的一种主要活性单体,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、调节机体免疫及诱导肿瘤细胞凋亡等作用[2]。研究发现,EGCG对多种肿瘤细胞增殖表现不同程度的抑制作用,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡,诱导肿瘤细胞周期阻滞,对细胞信号传导通路的影响等有关[3]。也有报道显示EGCG对正常的表皮角质形成细胞有促增殖作用[4]。2006年Kwon 等[5]首次报道了EGCG可促进人毛发生长。国内李梅云、范卫新等[6]研究也发现一定浓度的EGCG可促进体外培养的人毛囊生长和毛乳头细胞增殖。目前国内外未见EGCG对毛发生长周期影响的相关报道。本研究以C57BL6小鼠为模型,设立阳性对照、阴性对照,观察外用EGCG溶液对毛发周期、毛囊密度、毛囊形态的影响。
　　C57BL6小鼠是研究毛发周期的动物模型,毛发呈周期性生长,毛发周期分生长期、退行期和休止期。。该小鼠毛发呈黑色,皮肤中的黑素细胞均分布于毛囊,仅在毛发生长期才合成分泌黑素,并将黑素传递给角质形成细胞,使皮肤呈黑色;在毛发退行期,黑素合成减少,皮肤逐渐由黑色变为灰色;休止期无黑素合成,皮肤呈粉红色。经组织学验证,该小鼠皮肤颜色的变化能反映毛发生长周期的不同时段。该小鼠在6～8周饲养良好状态下,所有毛囊均由生长期(皮肤黑色)进入休止期(皮肤粉色)状态,而且在生理状态下不再自发进入生长期,但经人为拔毛后可被诱导进入生长期,拔毛后第5～6天 皮肤颜色变黑(生长期第Ⅳ亚期),黑色持续12天又转为灰色(退行期),2天后皮肤转为粉红色(休止期)[7]。
　　米诺地尔溶液是临床应用极为广泛的一种治疗各类脱发的药物,有研究表明,其可以使毛发提前进入生长期,延长生长期时间,并缩短休止期,并能使毛囊增大[8]。故本研究选用5%米诺地尔溶液为阳性对照。
　　本实验发现,与阴性对照组小鼠相比,实验组小鼠皮肤颜色提前 24h由粉红色变为黑色,推迟24h由黑色变为灰色,毛囊生长期时间较阴性对照组长近72h,表现与阳性对照组结果相似。提示EGCG与米诺地尔一致,可诱导毛囊进入生长期,延长生长期时间,并推迟进入退行期。我们还发现,实验第4天时,切取每组小鼠背部皮肤,观察到实验组和阳性对照组皮下血管网丰富,血管较粗;而基质组和阴性对照组未见此现象。推测EGCG和米诺地尔一样具有促进血管增生的作用。同时在实验第20天,我们观察到实验组、阳性对照组与阴性对照组小鼠毛囊数目,在统计学上均具有极显著性差异,P0.05;实验组与阳性对照组相比较无显著性差异,P>0.05。由此可见EGCG具有促进毛囊生长的作用,且此作用与米诺地尔相当。
　　本研究结果显示EGCG可诱导C57BL6毛囊进入生长期,延长生长期时间,并推迟进入退行期,具有促进毛囊生长的作用,可能与其促进血管增生作用有关。国内外均有研究发现EGCG可促进人毛发及体外培养的毛囊生长和体外培养的毛乳头细胞增殖。但人与动物有着种属差异,故EGCG促进毛发生长作用的机制有待进一步的研究。
　　
　　[参考文献]
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　　[3]Ahmad N,Cheng P,Mukhtar H. Cell cycle dysregulation by green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate[J]. Biochem Biophys Res Commun,2000, 28,275(2):328-334.
　　[4]Hsu S,Bollag WB,Lewis J,et al. Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes[J]. J Pharmacol Exp Ther,2003,306(1):29-34. Epub 2003 Mar 27.
　　[5]Kwon OS,Han JH,Yoo HG. Human hair growth enhancement in vitro by green tea epigallocatechin-3-gallate (EGCG) [J]. Phytomedicine,2007,14(7-8):551-555.
　　[6]李梅云,范卫新,周乃慧. 表没食子儿茶素没食子酸酯对体外培养的人毛囊生长和毛乳头细胞增殖的影响[J].中华皮肤科杂志,2008,41(2):173-175.
　　[7]Paus R,Hofmann U,Eichmuller S,et al. Distribution and changing density of gammadelta T cells in murine skin during the induced hair cycle[J]. Br J Dermatol,1994,130: 281.
　　[8]Tu Jun-Bo,Yang Zhuang-Qun, He Xi-Jing, et al. Effect of ethosomal minoxidil on dermal delivery and hair cycle of C57BL/6 mice[J]. J Dermatolog Sci,2007,45:135-137.
　　
　　[收稿日期]2009-11-12 [修回日期]2010-02-03
　　编辑/张惠娟