腺病毒转染步骤_siRNA,c-Met腺病毒转染对人外泌汗腺上皮细胞增殖的影响

　　[摘要]目的:研究siRNA c-Met腺病毒转染对培养的人外泌汗腺上皮细胞(human eccrine sweat gland epithelial cells,hESGc)增殖的影响。方法:按我科已经建立的方法培养和鉴定hESGc,取第1代细胞备用。构建表达红色荧光蛋白的siRNA c-Met腺病毒, 荧光显微镜观察和Westernlot检测证实病毒的有效性。MTT法检测siRNA c-Met腺病毒对hESGc增殖的影响。结果:荧光显微镜下可见转染了siRNA c-Met腺病毒的hESGc有红色荧光表达,转染后48h,收集细胞进行westernblot检测,结果发现,siRNA c-Met腺病毒转染能抑制hESGc细胞中c-Met蛋白的表达,抑制率达70%以上,MTT法检测发现转染siRNA c-Met腺病毒能抑制hESGc增殖,抑制率分别为16.8%(2天)和34.5%(4天)。结论:siRNA c-Met腺病毒转染能抑制hESGc的增殖。
　　[关键词]c-Met;外泌汗腺;上皮细胞;增殖
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)09-1324-03
　　
　　Inhibitory effects of knockdown of c-Met by Adenovirus-delivered siRNA on growth of human eccrine sweat gland epithelial cells
　　LEI Xia1, LIU Bo2, WU Jin-jin1, LU Yuan-gang1, Yang Ya-dong1
　　(1. Department of Dermatology, Daping Hospital,Third Military Medical University, Chongqing, 400042,China;2. Department of Orthopadics, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University)
　　
　　Abstract: ObjectiveTo investigate the effect of siRNA c-Met adenovirus on proliferation of cultured hESGc.Methods The recombinant adenoviral vector containing siRNA targeting c-Met gene was successfully constructed. Adenovirus with high titer was harvested. Fluorescence microscope observation and westernblot test were used to confirm the effectiveness of adenovirus. MTT assay was used to detect the growth of the cells.ResultsRed fluorescence was observed in hESGc infected with siRNA c-Met adenovirus under fluorescence microscopy.The infected cells were harvested for westernblot test. It is observed that c-Met was inhibited in siRNA c-Met adenovirus infected cell group. The transfection of siRNA c-Met adenovirus can inhibit the growth of hESGc by MTT assay.The inhibition rate were 16.8% in 2 days and 34.5% in 4 days.ConclusionThe transfection of siRNA c-Met adenovirus can inhibit the growth of hESGc.
　　Key words:c-Met; eccrine sweat gland; epithelial cell; proliferation
　　
　　C-Met是至今唯一被认识的肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)高亲和力受体,由c-Met基因编码,HGF与c-Met结合后,可诱导其发生构像变化,进而激活磷酸化通路,逐级放大信号,从而发挥HGF的生物学效应。不少实验表明,HGF/c-Met信号通路与多种细胞增殖,器官发生,肿瘤生长和转移等生物学行为有关[1]。已有实验表明,人外泌汗腺上皮细胞(Human Eccrine Sweat Gland Epithelial Cells,hESGc)上存在c-Met受体,加入HGF能促进hESGc增殖[2],但下调c-Met表达对hESGc的影响尚不明确。RNA干扰是一种新兴的基因抑制技术,原理是通过设计小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA),介导序列高度同源的靶基因mRNA降解,下调靶基因表达[3]。本文拟利用重组腺病毒介导的siRNA技术下调c-Met表达对hESGc体外增殖的影响。
　　1 材料和方法
　　1.1 实验材料与试剂:无血清角质形成细胞培养基(keratinocyte serum free medium,KSFM)和DMEM培养基购自美国Gibco 公司, FITC-Annexin V试剂盒购自美国Trevigen公司,抗Marker 相对分子质量标准品和兔抗c-Met多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司,鼠抗β-actin 抗体购自美国Novus 公司,其他分子生物学试剂购自美国Sigma 公司,pSES-HUS及腺病毒骨架质粒pAdEasy-1, 由美国芝加哥大学分子肿瘤实验室TC. He教授惠赠;限制性内切酶Sfi I, EcoRV, KanI, PmeI,PacI和T4 DNA连接酶 购自美国TaKaRa 公司和New England Biolabs(NEB)公司,Wizard Plus质粒纯化系统购自美国Promega 公司;Bio-Tek多功能读板机购自美国Bio-Tek Synergy HT公司,CKX41-32PH 型倒置相差显微镜及照相系统购自日本Olympus 公司,BioImaging Systems购自美国UVP 公司,FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司。
　　1.2实验方法
　　1.2.1 细胞培养:hESGc在KSFM 中按我科已经建立的方法培养和鉴定[2],取第1代细胞备用。
　　1.2.2 重组腺病毒载体的构建:从GenBank中检索到c-Met的cDNA序列(登录号:NM-000245),按照siRNA设计的原则选取靶序列。正义链5"-AGGACAATGATGGCAAGAAATTTT-3",反义链5"-ATTTCTTGCCATCATTGTCCTTTT--3"。参照He等[4-5]的方法先构建腺病毒穿梭质粒pSES-siRNA-c-Met,经Pme I 酶切线性化后,与病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,再经Pac I酶切纯化后转染HEK293细胞包装出重组腺病毒,经荧光显微镜下观察红色荧光表达,即为构建成功,命名为AdR-siRNA c-Met,于HEK293细胞中扩增。取仅含有红色荧光蛋白RFP的空病毒(Ad-RFP)做对照。
　　1.2.3 SiRNA met腺病毒转染hESGc细胞:第1代的hESGc细胞接种于6孔板,KSFM培养,细胞的密度约60%～80%时,测定hESGc细胞的最适感染复数,每孔分别加入AdR-siRNA c-Met 0μl、2μl、4μl、8μl、16μl、48h后,在荧光显微镜下观察,统计表达RFP的细胞百分比(感染效率),取感染效率80%以上,同时细胞没有明显由病毒本身引起的细胞毒现象的病毒量,最终确定为4μl AdR-siRNA c-Met病毒液/孔。同理对照组Ad-RFP合适的病毒量亦为4μl Ad-RFP病毒液/孔。由于培养hESGc细胞时,6孔板每孔中培养基约1ml,故适合用于转染的病毒浓度为4μl病毒原液/ml培养基。
　　1.2.4 Westernblot检测: 培养14h后,细胞用PBS洗两遍后,加入新鲜的KSFM培养基,转染后48h,取细胞做westernblot检验,明确AdR-siRNA c-Met的有效性。设置对照组(无影响因素),阳性对照组(Ad-RFP转染)和实验组(AdR-siRNA c-Met转染),在转染后48h收集各组细胞,加入RIPA细胞裂解液,超声破碎细胞,提取各组细胞总蛋白并采用BCA定量,取等量总蛋白(40μg)上样,电泳,电转, 5%脱脂牛奶封闭3h, 加一抗(兔抗c-Met多克隆抗体,小鼠抗β-actin 抗体),室温孵育2h,洗膜,加二抗(抗兔IgG-HRP,抗小鼠IgG-HRP),室温孵育1h,洗膜,化学发光法检测,曝光,显影,定影,记录实验结果,Western blot 法测得所有数据均采用UVP BioImaging Systems 采集,将X 线片扫描后的图像数据输入LabWork 3.0 软件进行图像分析,将内参β-actin 作为标准积分吸光度(standard integral absorbance,SIA),各目的条带相对积分吸光度值(relativeintegral absorbance,RIA)=样本积分吸光度值(integral absorbance,IA)/ SIA。
　　1.2.5 MTT法检测细胞增殖: 实验分成4组,空白组,对照组,阳性对照组和实验组。空白组不含细胞,仅于96孔板加入200μl KSFM,对照组,阳性对照组和实验组均于96孔板按 2×103个/孔接种hESGc,对照组每孔加入200μl KSFM,阳性对照组每孔加入含4μl /mL Ad-RFP 腺病毒的KSFM 200?l,实验组每孔加入含4μl /ml AdR-siRNA c-Met 的KSFM 200μl 。每一组每一时相点设六复孔。各组在0天,2天,4天时采用MTT法检测细胞增殖情况。从孵箱中取出待测96 孔板,每孔加入MTT 溶液(5g/L)20μl,继续培养4h,弃上清,每孔加入DMSO 100μl,振荡10min,在Bio-Tek 多功能读板机570 nm 波长测定吸光度(A)值,并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(阳性对照组A 值-实验组A 值)/ 阳性对照组A值×100%。
　　1.2.6 统计学方法:采用SPSS11.0 统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK,P值0.05)。腺病毒转染hESGc后,2天,4天均能抑制细胞的增殖,实验组A值与阳性对照组和对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。
　　
　　3讨论
　　HGF是一个多效应生长因子,具有多种生物活性,参与机体多种器官组织细胞生长、再生和重塑,研究表明,HGF对多种细胞均有促进增殖和运动的作用,如BMSCs、平滑肌细胞、牙髓细胞、肾小管上皮细胞、角膜上皮细胞以及视网膜上皮细胞等[6-8]。c-Met是HGF特异性受体,其在组织中广泛存在,但是上皮细胞中表达浓度最高[9]。HGF与c-Met结合后,可诱导其发生构像变化,激活受体胞内蛋白激酶结构域中的蛋白酪氨酸激酶(PTK) ,使受体自身的酪氨酸残基磷酸化而激活受体[10]。除自身磷酸化外,c-Met 蛋白的酪氨酸激酶活性可导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化,经瀑布式磷酸化反应,将信号逐级放大,最终转入细胞核内的转录机构,导致细胞的增殖、分化[11]。
　　汗腺起着排汗,调节体温,物质交换等重要作用,深入研究汗腺细胞的生物学行为的影响因素,对揭示汗腺及其他管状系统的发育和功能有着重要的意义,我们既往的研究表明[12],hESGc上有HGF特异性受体c-Met表达,含40～80ng/ml的HGF的培养基能明显促进hESGc的增殖,20～40ng/ml HGF可促进hESGc细胞移行(P 　　[5]He TC, Zhou SB, Costa L,et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses[J]. Proceed NationAcaSciUSA ,1998, 95:2509-2514
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　　[收稿日期]2010-06-20[修回日期]2010-08-18
　　编辑/张惠娟