瘦素调节基因_瘦素对脂肪细胞的直接调节作用

　　[摘要]目的：观察瘦素对人脂肪细胞分解代谢及脂肪蓄积的直接影响，探讨脂肪细胞的自分泌调节作用。方法：取正常成人皮下脂肪组织，常规提取和培养前脂肪细胞，待细胞融合后诱导分化为成熟脂肪细胞并随机分为四组：正常对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组，分别培养于含瘦素浓度为0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的培养液a中。培养4h后收集培养液检测游离脂肪酸和甘油浓度，取脂肪细胞经油红O染色后图像分析计算脂肪颗粒的积分光密度。结果：与对照组相比，低浓度组培养液中游离脂肪酸和甘油浓度分别增加87%（P 　　
　　1.1材料：无内分泌及代谢性疾病的成人上腹部皮下脂肪组织，重组人瘦素（Pepro TechUSA），胶原酶IV（Gibco USA），转铁蛋白、生物素、泛酸钙、胰岛素（Sigma USA），脂肪酸和甘油试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）等。
　　1.2 培养液的配制：①培养液a：DMEM/F12（1∶1）混合培养液（含10%FBS、33μmol/L生物素、17μmol/L泛酸盐、10万IU/L青霉素和100mg/L链霉素）；②培养液b：DMEM/F12（1∶1）混合培养液（含33μmol/L生物素、17μmol/L泛酸盐、10万IU/L青霉素和100mg/L链霉素,5mg/L 胰岛素、10mg/L转铁蛋白、10μg/L bFGF）
　　1.3 人前脂肪细胞培养：常规培养人前脂肪细胞：切取人上腹部皮下脂肪组织，DMEM培养液(含100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素)浸泡脂肪组织10min，剔除肉眼可见的血管和筋膜等其他组织；Hank’s液(含100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素)冲洗3遍后移入无菌的三角烧瓶，眼科剪剪成直径约1mm的小组织块，加入0.2%胶原酶IV 37℃水浴消化10min，含10%FCS的DMEM培养液终止消化。100目、200目不锈钢筛网先后过滤，取细胞悬液，离心（1 700rpm 10min）后弃上清；加入0.16mol/L NH4Cl作用10min，Hank’s液（含100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素）洗涤2次后离心（1 700rpm10min），弃上清。培养液a悬浮细胞，按1×105个/ml浓度接种于12孔板，置37℃、5%CO2培养。每日观察，每2天换液一次。
　　1.4 前脂肪细胞向脂肪细胞的诱导
　　1.4.1脂肪细胞诱导：参考目前常用诱导方法[6-7]，待前脂肪细胞生长融合后，PBS洗涤细胞2次，用无血清的培养液b于37℃、5%CO2诱导培养。每天观察，每2天换液一次。诱导培养一周后行下一步实验。
　　1.4.2 脂肪细胞鉴定：称量1.4g油红O充分溶解于400ml异丙醇，室温静置过夜，过滤后为贮存液，避光保存。工作液按3倍体积贮存液加入2倍体积蒸馏水临时配制。
　　油红O染色：吸去培养液，PBS漂洗2次，10%甲醛固定30min，滴入2ml油红O工作液浸染15min。弃油红O工作液，PBS漂洗1次，光镜下观察。1.5 脂肪细胞分组：脂肪细胞诱导分化后，培养液a培养于37OC、5%CO2。随机分为四组：正常对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组，接种于12孔板，每组10孔。培养液中瘦素终浓度正常对照组0ng/ml，低浓度组10ng/ml，中浓度组100ng/ml，高浓度组1 000ng/ml。培养4h后取各组培养液按试剂盒说明检测游离脂肪酸和甘油浓度。收集脂肪细胞行油红O染色，拍照后图像分析。
　　1.6培养液中游离脂肪酸浓度检测：按试剂盒步骤检测各组培养液中游离脂肪酸浓度。游离脂肪酸经过有机抽提和铜皂化，进行显色反应，用分光光度计测定546nm OD值，对照标准曲线计算游离脂肪酸浓度。
　　1.7 测定培养液中甘油浓度：采用GPO Trinder酶学反应，操作按试剂盒说明进行，最后用分光光度计在505nm波长测定各组OD值，绘制标准曲线计算甘油浓度。
　　1.8 脂肪细胞中脂肪颗粒积分光密度测定：收集各组脂肪细胞行油红O染色，然后沿各孔垂直、水平径在光镜下对染色后的细胞进行拍照，每孔9张。应用Image-pro plus图像分析软件测定脂肪细胞中脂肪颗粒的积分光密度。
　　1.9 统计学分析：结果以均数±标准差（x±s）表示，应用 SPSS12.0统计软件行单因素方差分析，组间参数两两比较行t检验。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 人前脂肪细胞的培养观察：细胞接种后可见大量漂浮的圆形细胞，24h后大部分细胞贴壁。初期细胞体积小，呈纺锤形或梭形，核浆比例大，仍有少数细胞未帖壁；换液后悬浮细胞渐被弃去，剩下贴壁生长的前脂肪细胞。7天左右细胞生长至融合，核浆比例减小，部分可见核分裂相（图1）。
　　
　　2.2 前脂肪细胞向脂肪细胞诱导分化和鉴定：加入无血清的培养液b后，前脂肪细胞停止增殖，形态由纺锤形或梭形逐渐膨胀，变成椭圆形和圆形，体积增大。48h后细胞内可以观察到圆形颗粒，颗粒每日增多，一周后达到高峰。细胞膜出现皱折，轮廓变淡。此时行油红O染色，可见大小不等的橘红色脂肪颗粒(图2)。
　　2.3各组游离脂肪酸及甘油浓度、脂肪颗粒积分光密度的检测，见表1。
　　
　　瘦素作用4h后，各组培养液中游离脂肪酸、甘油浓度及脂肪细胞脂肪颗粒积分光密度检测结果如表1所示。与正常对照组相比，低浓度组、中浓度组、高浓度组游离脂肪酸、甘油浓度均明显增加，差异有统计学意义（P 　　本研究在瘦素作用4h后检测了培养液中游离脂肪酸和甘油浓度、脂肪细胞中脂肪颗粒的积分光密度，观察了瘦素对脂肪细胞的瞬时直接调节作用；发现瘦素能直接调节脂肪细胞分解代谢、影响脂肪蓄积，并且该调节作用呈剂量依赖性，这可能在肥胖发病机制中起重要作用；为进一步探讨脂肪细胞的自分泌调节通路及其在肥胖发生中的作用提供了实验依据。
　　
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　　[收稿日期]2007-06-15 [修回日期]2007-09-02
　　编辑/张惠娟