牙周膜成纤维细胞 [MMP-1在人牙周膜成纤维细胞中的表达]

　　[摘要]目的:在基因和蛋白水平检测体外培养人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)金属基质蛋白酶-1(MMP-1)的表达情况。方法:①收集4～6代体外培养的人PDL细胞,使用PCR方法检测细胞内MMP-1的基因表达;②取细胞外液用Western blot方法检测MMP-1蛋白表达。结果:PCR结果显示MMP-1在PDL中基因水平上有表达,而Western blot结果在蛋白水平上也证明了MMP-1在PDL中有表达,结论:体外培养的PDL具有MMP-1的功能。
　　[关键词]人牙周膜成纤维细胞;MMP-1;Western blot;PCR
　　[中图分类号]R783[文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)03-0372-02
　　
　　Expression of MMP-1 in human periodontal ligament fibroblasts
　　LIU Xin-wei1,CAO Jun1,LI Zhi-dong2,WANG Yuan2,LIU Qi1 ,ZHANG Zi-chuan1;XU Jing3
　　(1.Department of Orthodontics,College of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China;2.Department of Microbiology,Fourth Military Medical University;3.Xi’an Second Hospital,Xi’an Stomatology Hospital)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo detect matrix metalloproteinase -1(MMP-1)gene expression level and protein level produced by human periodontal ligament fibroblasts (HPDLF) cultured in vitro without stimulation. Methods①To collect human PDL cells cultured in vitro and detect gene expression of MMP-1 using PCR;②To detect protein expression of MMP-1 in the extracellular fluid using Western blot. ResultsPCR has proved the gene of MMP-1 expresses in the PDL,while the Western blot has showed the protein level of MMP-1 also expressed in the PDL. Conclusion MMP-1can be produced by PDL cultured in vitro without stimulation.
　　Key words:HPDLF;MMP-1;Western blot;PCR
　　
　　基质金属蛋白酶(matrix metallop roteinases,MMPs)是一组含Zn2+的能够降解细胞外基质的蛋白酶家族,是细胞外基质降解的关键酶。生物体内的很多生理、病理改建都与这种物质相关,如MMP-1等能溶解牙骨质中的非钙化有机质,与牙根吸收的发生机制相关。研究拟用Western blot和PCR方法在蛋白和基因水平分别研究体外培养的PDL在无干涉的情况下分泌MMP-1的情况,以确定在正常生长状态下,PDL是否有分泌表达MMP-1的功能,从而有助于分析生理状态下组织改建所需的MMP-1的细胞来源,以及分析PDL在这种改建中所起的作用。同时本研究还有助于明确PDL是否可以作为MMP-1的物质来源细胞,研究其调控表达机制,从而分析牙根吸收等病理活动的发生机制。
　　
　　1材料和方法
　　1.省略公司);兔抗二抗;离心机;多功能电泳检测仪;转膜仪。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 HPDLF的体外培养:收集12～18岁患者正畸拔除的健康前磨牙,无菌条件下刮取牙根中1/3处牙周膜组织,组织块法培养原代牙周膜细胞,培养的细胞经SABC免疫细胞化学检测呈抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性,表明细胞来源于中胚层,证实为牙周膜成纤维细胞。取其第4～6代细胞进行实验。弃培养液,加入0.25%胰酶+0.1%EDTA混合消化液消化细胞,约1min,用含10%小牛血清的DMEM终止。800r/min离心混匀,调整细胞密度,按2×10/ml接种在6孔培养板表面24h细胞贴壁后更换含10%胎牛血清的DMEM,培养24h,使细胞相对同步化,备用。
　　1.2.2人牙周膜成纤维细胞分泌MMP-1表达的基因水平检测:利用Primer Express(ABI,Foster City,CA)程序设计MMP-1鉴定引物。
　　引物序列如下:上游引物: 5"-GCCACAAAGTTGATGCAGTT-3"
　　 下游引物: 5"-GCAGTTGAACCAGCTATTAG-3"
　　以上引物均由TaKaRa生物工程公司合成,扩增片段长度105bp。循环条件:95℃ 5min预变性,95℃ 1min,58℃ 30s,72℃ 1min,30个循环,72℃ 10min延伸。细胞总RNA提取及逆转录:取4代HPDLF根据TaKaRa公司PCR KIT(AMV)VER.3.0试剂盒产品说明提取总RNA。根据TaKaRa公司RTase M-MLV试剂盒操作说明将2μm总RNA逆转录成cDNA。将cDNA 产物进行PCR 扩增后,电泳检测PCR扩增产物,PCR反应结束后,在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳,电压为120V,采用DL-2000 DNA marker,所得结果拍照并扫描。
　　1.2.3人牙周膜成纤维细胞分泌MMP-1表达的蛋白水平检测:分别取阳性对照hepG2细胞,实验对象HPDLF细胞,阴性对照。为防胎牛血清内蛋白干扰,待用细胞弃去DMEM培养液,无血清DMEM反复吹打后用无血清DMEM孵育1h后,取细胞上清,离心后测蛋白浓度,提取蛋白,加入5×SDS凝胶加样缓冲液,沸水煮6min,每孔上样20μl,行12%十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳,采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。TBST震荡洗涤3次,10min/次;后用含10%脱脂奶粉的TBS封闭2h;TBST震荡洗涤3次,10min/次;一抗封闭4℃过夜(1:500);TBST震荡洗涤3次,10min/次:二抗封闭2h(1:2 000);TBST震荡洗涤4次,10min/次。化学法发光,胶片显色,分析结果。
　　
　　2 结果
　　2.1 人牙周膜成纤维细胞分泌MMP-1表达的基因水平检测结果:HPDLF细胞裂解液PCR结果显示,HPDLF在无外界刺激情况下,在基因水平上有表达(如图1)。
　　3.2 Western blot检测MMP-1蛋白的表达:PBS孵育的HPDLF细胞和阳性对照hepG2细胞均在60KDa上出现清晰条带,但作为阴性对照的位置却没有出现条带(如图2)。
　　3 讨论
　　本研究中,我们通过PCR和Western blot方法在细胞外液中对MMP-1进行检测,结果显示,在没有外界刺激的前提下,PDL细胞是可以分泌MMP-1的,这提示正常生长状态下PDL细胞有分泌MMP-1的功能。如笔者前面所述的那样,MMP-1作为金属蛋白激酶家族中的一员,与机体生理及病理状态下的组织改建是密切相关的。例如,在正常的骨组织的新陈代谢中,MMP-1参与骨的吸收与改建,在骨吸收过程中,MMP-1可去除骨表面未矿化层,将刺激吸收的矿化骨质暴露于破骨细胞,同时,分解胶原这一过程也是由MMP-1启动的。这一步骤是其它MMPs进一步分解胶原碎片的前提条件。在正畸牙齿移动过程中,胶原纤维的分解断裂是牙根吸收的一个关键因素[1],胶原蛋白的降解包括细胞的内降解与细胞外降解两个途径。细胞外基质的降解主要依靠丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶和MMP等4类蛋白水解酶,其中MMP最为重要,能降解几乎细胞外基质的所有成分,包括天然和变性的不同种类的胶原[2];而在牙根吸收发生时,有研究表明牙根吸收的关键在于PDL中胶原纤维的清除[1]。以往的实验曾经证明,正畸过程中,机械力的使用传递至牙周,引起MMP-lmRNA表达的变化。体外研究[3]发现在牵张力作用下,PDL和牙龈成纤维细胞对MMP-1mRNA的表达增加。体内实验[4]则表明,压力和张力都可导致狗PDL中MMP-1的mRNA水平和其活性的明显上升。而参与上述关于MMP-1的研究,大多是针对外界给予各种干涉下进行检测的,MMP的表达在未受刺激的细胞中较低,但是部分在各种细胞外刺激因素诱导下(包括生长因子,细胞因子肿瘤促进剂,紫外线和红外线辐射),含量升高[5]。比如,Domeij等[6]在研究提到,用IL-1β、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)和ECF因子诱导人牙龈成纤维细胞产生MMP-1。本实验则是针对无干涉情况下进行蛋白和基因方面的检测,这一结果也与以往的研究有不同之处。
　　同时,本研究结果明确显示的PDL细胞具有分泌MMP-1的功能,与成牙本质细胞的培养相比,PDL的体外培养方法简单容易掌握,这提示我们可以以PDL细胞作为MMP-1的物质来源细胞,研究其调控表达机制,从而分析牙根吸收等病理活动的发生机制。这一结果,一方面提示PDL细胞是牙根吸收活动中MMP-1表达增强的细胞来源之一,也为进一步研究牙根吸收中MMP-1的干涉调控奠定基础做刺激情况下对比PDL分泌MMP-1实验提供依据。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2009-11-16 [修回日期]2010-01-25
　　编辑/何志斌