桂花OfPSY、OfPDS和OfHYB基因启动子克隆及表达特性分析

周俊杰，王艺光，董 彬，赵宏波

（1.浙江农林大学 浙江省园林植物种质创新与利用重点实验室，浙江 杭州 311300；
2.浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 杭州 311300）

类胡萝卜素是一种亲脂类异戊二烯，是一种自然界中广泛存在的生物色素，主要反射黄色、橙色和红色的光[1]。在植物器官中，类胡萝卜素在质体中的积累对吸收过量光能、清除活性氧、合成植物激素提供前体物质都起重要的作用[2]。八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase, PSY)是类胡萝卜素合成途径中的第1个限速酶，它的作用是将2分子的香叶酰香叶酰二磷酸(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)合成无色的八氢番茄红素[3]。随后，八氢番茄红素经过包括八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)在内的4次去饱和反应和2次异构化反应的多顺式转化，最终生成红色的全反式番茄红素[4]。而β-羟化酶(β-carotene hydroxylase，HYB)既可以单独作用使β-胡萝卜素经羟化作用转化为紫黄质，也可与ε-羟化酶(ε-carotene hydroxylase，HYE)协同作用使α-胡萝卜素经羟化作用形成叶黄素[5]。桂花Osmanthus fragrans是重要的观赏植物，花色和花香是其主要观赏性状。已有研究发现：类胡萝卜素既是桂花花瓣中主要色素成分[6]，也是桂花香气物质的前体物质[7]。目前已在多种植物中发现，植物器官中的类胡萝卜素含量及相关基因的表达水平受到多种因素的影响，如温度[8]、光照[9]、干旱胁迫[10]、乙烯[11]等。前期研究[12]发现：在200 mg·L−1脱落酸处理下，桂花花色明显加深，花瓣类胡萝卜素含量上升，类胡萝卜素合成关键基因OfPSY、OfPDS和OfHYB表达水平显著上调。相关基因在前人的研究中均已克隆到[13−15]，但对其调控的作用机制仍知之甚少。基因的启动子作为上游调控因子识别并结合的部位，是基因表达调控的重要作用位点。为进一步揭示桂花花色形成及其调控的分子机制，本研究克隆了OfPSY、OfPDS和OfHYB基因的启动子，通过作用元件分析、表达载体构建和瞬时表达分析，初步明确其作用。

1.1 植物材料

8～10年生丹桂品种‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhong Gui’栽植于浙江农林大学桂花资源圃；
烟草Nicotiana benthamiana栽培于浙江农林大学园林植物实验室。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒、Premix Taq聚合酶、质粒载体PMD18-T、大肠埃希菌Escherichia coliDH5α、切胶回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、限制性内切酶EcoR Ⅰ、NcoⅠ、DNA连接酶等购自Takara公司 (大连)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 参照DNA提取试剂盒所用方法提取桂花‘堰虹桂’基因组DNA。

1.3.2 引物设计与合成 根据桂花基因组数据[16]中的OfPSY、OfPDS、OfHYB基因启动子序列，用Primer Premier 5.0分别设计上下游引物。引物由有康生物公司(杭州)合成(表1)。

表1 启动子克隆所用引物Table 1 Primers used for promoter cloning

1.3.3 桂花OfPSY、OfPDS、OfHYB基因启动子克隆及序列分析 以桂花‘堰虹桂’基因组 DNA 为模板，分别用引物OfPSYP-F和OfPSYP-R、OfPDSP-F和OfPDSP-R、OfHYBP-F和OfHYBP-R对其启动子进行扩增。将扩增产物连接至质粒载体PMD18-T并转化大肠埃希菌DH5α，随后鉴定阳性克隆并送至有康公司(杭州)测序。启动子作用元件分析通过在线网站Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行。

1.3.4 桂花PSY、PDS、HYB启动子驱动 LUC 基因表达载体构建 设计包含酶切位点的引物 (表 2)，用于构建启动子表达载体。使用限制性内切酶EcoRⅠ和NcoⅠ分别对PCAMBIA3301-LUC载体和添加了酶切位点的启动子进行双酶切。用T4连接酶连接回收的启动子和载体片段。再经转化大肠埃希菌DH5α鉴定，得到重组的PSYP::LUC、PDSP::LUC、HYBP::LUC载体。再将重组质粒转化农杆菌Agrobacterium tumefaciensGV3101。

表2 构建 PCAMBIA3301-LUC 载体所用引物Table 2 Primers used to construct PCAMBIA3301-LUC vector

1.3.5 桂花OfPSY、OfPDS、OfHYB启动子烟草中瞬时表达 将含有重组质粒的农杆菌菌液在含有利福平和卡那霉素的 LB 培养基中振荡培养至D(600)达 0.8～1.0，在 4 ℃ 下以 4 000 r·min−1离心 10 min，收集菌体，随后以 2 mL 含 10 mmol·L−1MES、10 mmol·L−1MgCl2和 150 μmol·L−1的乙酰丁香酮的悬浮液重悬菌体2次。选取长势较好的烟草，将悬浮液用1 mL注射器从叶片下表皮注射到烟草叶片中直至整个叶片呈现水渍状。将烟草置于暗处培养1 d后转移至人工气候室继续培养1～2 d，随后将植株分别进行 37 ℃ 处理和 200 mg·L−1脱落酸喷施处理，12 h 后将注射后的叶片取下，喷洒 1 mmol·L−1的荧光素钠盐溶液，暗处放置5 min后在CCD冷冻发光仪下观察LUC荧光信号。参考Luciferase (Promega)荧光素酶报告系统试剂盒对酶活性进行检测，以对照组的比值为单位1，得到不同处理组的相对Luciferase活性，每组实验均包括3次技术重复和生物学重复。利用SPSS 19.0软件进行数据差异分析。

2.1 启动子克隆及序列分析

以桂花‘堰虹桂’基因组DNA为模板，用引物OfPSYP-F和OfPSYP-R、OfPDSP-F和OfPDSP-R、OfHYBP-F和OfHYBP-R对其启动子进行扩增，分别得到OfPSY启动子长度为1 908 bp (图1)，OfPDS启动子长度为 1 521 bp (图 2)，OfHYB启动子长度为 1 830 bp (图 3)的序列。利用 Plant CARE 在线软件对启动子序列的结合位点进行分析。在OfPSYP中，存在TATA-box、CAAT-box等启动子基本元件，和光响应元件、脱落酸(ABA)响应元件、赤霉素响应元件等响应元件，以及MYB、MYC结合位点(表3)；
在OfPDSP中，存在TATA-box、CAAT-box等启动子基本元件，和脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、光响应元件、厌氧诱导型元件、防御和胁迫响应元件等响应元件，以及MYB、MYC结合位点(表4)；
在OfHYBP中，存在TATA-box、CAAT-box等启动子基本元件，和脱落酸响应元件、生长素响应元件、低温响应元件、乙烯响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、光响应元件、厌氧诱导型元件等响应元件，以及MYB、MYC结合位点(表5)。

表3 OfPSY启动子中的顺式作用元件Table 3 Cis-acting elements in OfPSY promoters

表4 OfPDS启动子中的顺式作用元件Table 4 Cis-acting elements in OfPDS promoters

表5 OfHYB启动子中的顺式作用元件Table 5 Cis-acting elements in OfHYB promoters

图1 OfPSY 基因的启动子序列Figure 1 Promoter sequence of OfPSY gene

图2 OfPDS 基因的启动子序列Figure 2 Promoter sequence of OfPDS gene

图3 OfHYB 基因的启动子序列Figure 3 Promoter sequence of OfHYB gene

2.2 启动子瞬时表达分析

重组载体瞬时表达的荧光成像结果显示：注射了含重组载体农杆菌的烟草叶片均显现出荧光(图4)，表明OfPSYP、OfPDSP、OfHYBP均能够驱动LUC报告基因的表达，具有启动子活性。相对于25 ℃处理的烟草叶片，在37 ℃处理下，注射了OfPSYP::LUC、OfPDSP::LUC和OfHYBP::LUC的烟草叶片呈现出更强的荧光信号；
在200 mg·L−1脱落酸处理下，注射了OfPDSP::LUC和OfHYBP::LUC的烟草叶片呈现出更强的荧光信号。结果表明：相对高温胁迫上调了OfPSY、OfPDS和OfHYB的启动子活性，脱落酸上调了OfPDS和OfHYB的启动子活性。

图4 瞬时表达分析 OfPSY、OfPDS 和 OfHYB 启动子表达特性Figure 4 Transient expression analysis of OfPSY, OfPDS and OfHYB promoter expression characteristics

植物中类胡萝卜素的成分和含量是由一系列酶促反应完成的。研究发现类胡萝卜素代谢关键基因的表达受到各种环境因素和激素的调控。在香蕉Musa nana中，高温可以上调α-胡萝卜素和β-胡萝卜素生物合成途径相关基因的转录水平[17]；
在蓝莓Vacciniumspp.中，红光和远红光对果实中类胡萝卜素合成和降解基因的表达均起到上调作用[18]；
在大豆Glycine max中，氯化钠(NaCl)、聚乙二醇(PEG)、高温、低温等胁迫和ABA处理对类胡萝卜素降解基因起明显的上调作用[19]。此外，转录因子对类胡萝卜素代谢关键基因的启动子存在直接调控作用。在柑橘Citrus reticulata中，CsMADS6基因可以结合CsPSY和CsPDS基因的启动子[20]，从而促进其基因的表达；
在番木瓜Carica papaya中，CpEIN3a既可以直接识

别并结合CpPDS和CpCHYB基因的启动子，也可与CpNAC1/2基因共同促进CpPDS的表达[21]，而CpSBP1则对CpPDS基因存在负调控作用[22]；
在胡萝卜Daucus carota中，DcAREB3可响应盐胁迫和ABA处理，识别并结合DcPSY2启动子的ABRE作用元件，从而促进其表达[23]。

前期通过对桂花进行ABA处理发现，相对于未处理的桂花，经200 mg·L−1ABA处理的桂花花瓣中的类胡萝卜素含量上升；
对花瓣中类胡萝卜素代谢关键基因实时荧光定量表达显示：经ABA处理后OfPSY、OfPDS、OfHYB等基因的表达量显著上调，推测ABA通过调控这几个基因的表达，从而影响了桂花花色[12]。本研究在OfHYB启动子中发现了4个ABRE作用元件，该作用元件被认为是AREB转录因子的结合位点[24]。研究发现AREB转录因子能够识别并结合2个相距较近的ABRE作用元件[25]。在OfHYB启动子的4个ABRE作用元件中，有3个元件之间相距19和12 bp，表明OfHYB基因极有可能受到ABA调控，与此同时，OfHYB启动子上发现了最多的激素响应元件，除ABA响应元件外，还存在生长素、茉莉酸甲酯和乙烯响应元件，表明OfHYB基因的表达可能受到多种激素的调控。本研究通过高温和外源施加ABA，研究了几个启动子表达特性，进一步验证了相对高温对OfPSY和OfHYB基因启动子以及ABA对OfPDS和OfHYB启动子表达的调控作用。此外，在3个基因启动子中均存在数个光响应元件，在桂花中已经发现OfCCD1的表达可能受光照影响[26−28]，说明桂花花色物质的合成与降解均可能与光信号传导有关，但其具体作用机制仍有待进一步研究。本研究克隆得到的启动子经瞬时表达验证均具有启动子活性，下一步可将其构建酵母单杂载体，通过寻找上游的调控因子，明确桂花花瓣类胡萝卜素合成基因转录调控的分子机制。