糖尿病视网膜病变及糖尿病性黄斑水肿患者血清中CTRP9的表达

景海霞，张 书，白惠玲，刘 勤，，朱晓燕

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的眼部微血管并发症。Yang等[1]调查发现，成年T2DM患者中DR的患病率为24.7%～37.5%，约1/10的T2DM患者将发展为威胁视力的DR[2]。由于T2DM的全球患病率持续上升，越来越多的患者受到DR的困扰，其中糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema，DME)和增殖型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)是导致患者中、重度视力丧失的主要原因。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9(C1q/tumor necrosis factor related protein 9，CTRP9)是一种主要由脂肪细胞分泌的细胞因子，已被证明与糖尿病及其相关并发症进展有关，但其在DR中的作用和机制目前尚不清楚。本研究通过分析不同阶段DR及DME患者血清中CTRP9的表达水平，探讨CTRP9在DR及DME发病中的作用，为早期预防及监测病情变化寻找有价值的生物学指标。

1.1对象选取2021-04/2022-04甘肃省人民医院眼科及内分泌科收治的T2DM患者135例作为试验组，根据免散瞳眼底照相结果分为无DR(non-DR，NDR)组(45例)、非增殖型DR(non-proliferative DR，NPDR)组(45例)、PDR组(45例)；
根据光学相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)结果将DR患者分为DME组(51例)、非DME组(39例)，眼底照相及OCT读片均由同一位经验丰富的眼底病医生完成。另选取同期年龄、性别与T2DM患者相匹配的健康体检者45例为正常对照组。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则，经甘肃省人民医院伦理委员会审核批准(批准号：2021-301)。所有受试者均签署知情同意书。

1.1.1纳入标准试验组：(1)年龄：45～75岁，经内分泌和眼科医生明确诊断为T2DM或DR的患者；
(2)T2DM的诊断符合2020年制定的《中国2型糖尿病防治指南》[3]；
(3)DR分期符合《我国糖尿病视网膜病变临床诊疗指南(2014年版)》中建议的分期方法[4]。正常对照组：无糖尿病病史，空腹血糖<7.0mmol/L，随机血糖<11.0mmol/L，糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)<6.5%。

1.1.2排除标准试验组：(1)1型糖尿病、妊娠期糖尿病、特殊类型糖尿病患者；
(2)既往有眼内手术史、眼内注药史(抗VEGF药物或糖皮质激素)、视网膜激光光凝史；
(3)有免疫性疾病、心脑血管疾病、血液系统疾病、恶性肿瘤、重度肝肾功能不全、严重感染性疾病者；
(4)近期有抗炎、激素及免疫抑制剂药物治疗史；
(5)近期有糖尿病高渗性昏迷、糖尿病酮症酸中毒者。正常对照组：糖尿病、高血压、合并心肝肾等严重功能障碍或患有其他全身性疾病，如炎症性疾病、风湿病、感染性疾病、恶性肿瘤及自身免疫性疾病者。

1.2方法

1.2.1临床资料收集记录所有受试者的性别、年龄、体质量指数(body mass index，BMI)及T2DM患者的糖尿病病程等临床资料。

1.2.2CTRP9及生化指标的检测收集所有受试者晨起空腹肘静脉血5mL。以4500r/min离心10min，立即提取上层血清，分装入无菌EP管内，置于-80℃超低温冰箱中待测。(1)血清CTRP9水平检测：采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测血清中CTRP9水平，严格按照试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司)说明操作进行，CTRP9可检测水平为17.5～700pg/mL，批内及批间变异系数分别小于10%和12%。(2)生化指标检测：使用Ci16200全自动化生化分析仪检测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)；
使用TOSOH HLC-723G11分析仪检测HbA1c。

2.1纳入受试者临床资料比较正常对照组、NDR组、NPDR组、PDR组受试者年龄及性别差异均无统计学意义(P>0.05)，但NDR组、NPDR组、PDR组患者糖尿病病程差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。DME组与非DME组患者年龄、性别、糖尿病病程差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 各组受试者基线资料比较

表2 DME组与非DME组患者基线资料比较

正常对照组、NDR组、NPDR组、PDR组受试者血清CTRP9水平差异有统计意义(P<0.001)，且正常对照组>NDR组>NPDR组>PDR组，见表3。DME组与非DME组患者血清CTRP9水平差异有统计学意义(P<0.001)，且非DME组>DME组，见表4。

表3 各组受试者临床资料比较

表4 DME组与非DME组患者临床资料比较

2.2血清CTRP9水平与临床资料的相关性分析Spearman秩相关性分析显示，T2DM患者血清CTRP9水平与糖尿病病程(rs=-0.345，P<0.001)、HbA1c(rs=-0.181，P<0.05)呈负相关关系，与BMI(rs=0.199，P<0.05)呈正相关关系；
DR患者血清CTRP9水平与糖尿病病程(rs=-0.251，P<0.05)呈负相关关系；
DME患者血清CTRP9水平与FBG(rs=-0.370，P<0.05)、HbA1c(rs=-0.421，P<0.05)呈负相关关系。

2.3DR及DME发生的危险因素分析

2.3.1DR发生的危险因素分析以是否发生DR为因变量，将糖尿病病程、BMI、HbA1c、HDL-C、CTRP9作为自变量，采用一次性进入法进行Logistic多因素回归分析，结果显示，糖尿病病程(OR=1.194，95%CI：1.068～1.335)、血清CTRP9水平(OR=0.936，95%CI：0.907～0.966)为影响DR发生的危险因素，且随着血清CTRP9水平降低，DR的患病风险显著增加，见表5。

表5 DR危险因素的Logistic回归分析

2.3.2DME发生的危险因素分析以是否发生DME为因变量，将CTRP9作为自变量，将变量采用一次性进入法进行Logistic多因素回归分析，结果显示，血清CTRP9水平为影响DME发生的危险因素(b=-0.176，SB=0.038，Waldχ2=21.424，OR=0.838，95%CI：0.778～0.903，P<0.001)，且随着CTRP9水平降低，DME的患病风险显著增加。

CTRP9是属于CTRP家族的脂联素旁系同源物之一，主要在脂肪组织中表达，与脂联素形成异源三聚体。gCTRP9是CTRP9主要的循环亚型，其是CTRP9的C端球状结构域异构体，CTRP9的蛋白水解切割则会导致球状结构域gCTRP9释放[5]。CTRP9可对多种与T2DM相关的危险因素起到抑制作用。研究发现，CTRP9在ob/ob肥胖小鼠脂肪组织、外周血中表达水平上调[6]，而CTRP9缺陷小鼠胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)加重[7]，这两项研究结果提示血清CTRP9水平与机体肥胖状态有关，且在改善IR方面有一定作用。Guan等[8]认为，CTRP9是一种抗炎因子，与哮喘、神经炎和DR等多种疾病炎症因子的产生呈负相关。此外，CTRP9还具有保护血管内皮细胞的作用[9-10]。Jung等[10]研究发现，CTRP9可以激活血管内皮细胞中的蛋白激酶，抑制白细胞黏附和血管炎症的发生，且其过表达可抑制核因子-kappaB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)的激活，说明CTRP9有抗氧化应激反应的作用。以上研究表明，CTRP9在改善IR、抗炎、保护血管内皮细胞及抗氧化应激等方面发挥重要作用。

本研究结果显示，正常对照组、NDR组、NPDR组、PDR组受试者血清CTRP9水平差异有统计意义(P<0.001)，且正常对照组>NDR组>NPDR组>PDR组，说明CTRP9水平降低可能在DR的进展中起重要作用。相关研究也表明，CTRP9水平降低是T2DM患者并发DR的危险因素[11]。王欣荣等[12]研究显示，CTRP9与T2DM患者并发DR独立相关，且随着DR的进展，CTRP9水平呈下降趋势，这与本研究结果一致。然而，在T2DM背景下，血清CTRP9水平与不同发展阶段DR的相关性研究鲜有报道。本研究结果显示，与NPDR组相比，PDR组患者血清CTRP9水平降低(P<0.05)，提示CTRP9与DR的严重程度有一定的相关性，即随着血清CTRP9水平降低，DR的严重程度增加，提示血清高水平CTRP9对于DR可能是一种保护因素。一项关于小鼠的体内研究表明，CTRP9过表达可降低空腹胰岛素水平和空腹血糖，增加胰岛素敏感性[13]。另有研究表明，CTRP9过表达可抑制细胞氧化应激和凋亡的发生[14]，可在一定程度上阻止DR的发展。此外，一项关于视网膜色素上皮细胞的研究报告发现，CTRP9除了有抗炎、抗氧化的作用，还可以改善视网膜的葡萄糖代谢、保护血管[15]。

本研究发现，与非DME组相比，DME组患者血清CTRP9的水平降低，差异有统计学意义(P<0.001)。DME的发病机制复杂，涉及大量炎性因子和炎性介质，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是引起DME的重要内源性介质，其过度产生可促使视网膜内皮细胞增殖和白细胞迁移，增加血管通透性，导致液体渗漏和视网膜新生血管形成[16]。研究表明，抗VEGF药物治疗可改善DME患者黄斑灌注状态并提高视力[17]，是DME的临床一线治疗方法。一项动物实验研究通过将表达CTRP9的腺病毒载体静脉注射到12周龄的db/db小鼠中发现，CTRP9可以平衡VEGF的表达[18]，提示CTRP9可能与VEGF的表达有关，但二者间的关系还需更多研究论证。此外，CTRP9还可抑制db/db小鼠血-视网膜屏障(blood retinal barrier，BRB)的分解和紧密连接蛋白的下调，研究人员通过免疫荧光染色和实时定量PCR检测Claudin-5、Occludin和ZO-1等紧密连接蛋白的水平评估CTRP9对BRB完整性的影响，结果显示，与正常对照组相比，DR组Claudin-5、Occludin和ZO-1等紧密连接蛋白的mRNA水平显著降低[18]，表明CTRP9可通过防止紧密连接蛋白的丢失保护BRB的完整性，从而抑制DME的发生发展。

CTRP9作为一种新型脂肪因子，在脂代谢的调节方面也发挥着一定的作用。汪化文等[19]发现，冠状动脉钙化患者血清CTRP3、CTRP9水平与部分血脂指标水平具有明显相关性，与TC、TG水平呈负相关，与HDL-C水平呈正相关。一项关于金银花调节血糖和血脂水平的研究指出，CTRP3/9-AdipoR1-AMPK通路对保护性脂质(甘油二酯、HDL-C)具有一定保护作用[20]。雷升云[21]采用不同浓度CTRP9刺激巨噬细胞发现，CTRP9可显著减少巨噬细胞内脂质沉积，同时还证明CTRP9可促进巨噬细胞内胆固醇流出相关蛋白的表达及胆固醇的流出。上述研究提示CTRP9与脂代谢产物有一定的相关性。本研究中Spearman秩相关性结果显示，T2DM及DR患者血清CTRP9水平与脂代谢产物无显著相关性，其他关于DR患者血清CTRP9的相关研究中也暂未发现其与脂代谢产物的相关性，分析原因可能与患者服用了降糖降脂药物有一定关系。

然而，本研究显示，随着血清CTRP9水平降低，DR与DME的患病风险显著增加，但CTRP9具体通过何种机制参与DR及DME的发生与发展，还有待进一步探讨。目前认为，CTRP9可通过激活几种信号通路发挥改善胰岛素敏感性、降低血糖、减轻炎症反应、抗氧化应激及保护血管内皮的作用。Zuo等[22]研究显示，CTRP9可激活AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、蛋白激酶B(Akt)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，从而调节血清胰岛素及葡萄糖水平。Jung等[10]研究显示，CTRP9通过激活脂联素受体1(adiponectin receptor 1，AdipoR1)/AMPK/NF-κB信号通路，下调肿瘤坏死因子-α、黏附分子及趋化因子的表达，减轻血管炎症。此外，CTRP9还可通过激活AMPK/核红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)信号通路，减弱高血糖诱导的视网膜色素上皮细胞中的氧化应激和细胞凋亡的发生[15]。上述研究结果表明，CTRP9与T2DM及DR的发生发展密切相关。

随着医疗水平及检测技术的提高，目前多数DR患者可通过早期诊断与及时干预有效避免视力严重下降。因此，寻找相应的分子标志物对DR及DME的早期诊断、预防或干预具有重要意义。本研究中，Logistic回归分析结果显示，血清CTRP9水平是影响DR及DME发生的危险因素，提示CTRP9未来有可能成为预防和治疗DR及DME的功能靶点。Zhang等[23]发现，gCTRP9作为CTRP9的亚型，对AMPK、Akt和内皮一氧化氮合酶的激活作用比CTRP9更强。因此，促进gCTRP9的产生可能是增强CTRP9生物学功能的有效途径。后续将进一步研究CTRP9与DR及DME有关的潜在机制，可能有助于预防或延缓其进展并探索新的治疗策略。

综上所述，血清CTRP9水平降低是DR及DME发生的危险因素，其可能成为临床上监测T2DM患者并发DR及DME的潜在参考指标，为预防或延缓DR及DME的发生提供参考。由于本研究是小样本横断面研究，因此仅初步推断CTRP9在预测DR及DME的发生发展方面具有一定价值，未来还需进行多中心、大样本的临床研究加以证实。另有研究发现糖尿病肾病是影响DR发生的危险因素[24]，本研究未能排除糖尿病肾病的影响。此外，由于T2DM患者病程较长，且多数患者服用降糖、降脂、保护神经等药物，因此CTRP9与血管并发症之间的关联可能受到药物等相关混杂因素的影响。