唾液腺紧密连接蛋白Claudin的研究进展

张鹏鑫，费润馨，许 辉

紧密连接(tight junction，TJ)位于相邻上皮接触顶端区域的细胞间连接处，是参与旁细胞分泌途径中蛋白质间相互作用的复杂动态系统。其主要功能分别是通过限制分子在细胞间的自由扩散，实现其屏障功能；
通过减少顶端和基底外侧质膜区域的相互影响，实现其栅栏功能，维持细胞极性[1-2]。紧密连接可构成唾液腺血液和组织液之间的细胞屏障，维持唾液单向分泌[3]。

紧密连接蛋白分为跨膜蛋白和细胞质蛋白，跨膜蛋白主要包括Claudin家族、Marvel蛋白家族、以及连接黏附分子家族。其中，Claudin家族构成紧密连接链(紧密连接跨膜蛋白胞外环)的主干，具有调节细胞通透性、增殖和分化等功能，并且对细胞生长及分化至关重要[4]。

Claudin蛋白表达模式与紧密连接结构和功能有密切关系。通过顺序敲除MDCK Ⅱ细胞系中主要表达的5种Claudin(Claudin-2、Claudin-4、Claudin-3、Claudin-7、Claudin-1)，生成五倍量Claudin基因敲除(quintuple knockout，quinKO)模型，观察到紧密连接链缺失[5]。以上结果表明，Claudin是紧密连接结构形成的必要条件。此外，大鼠唾液腺放射损伤后分泌功能降低，Claudin-4表达水平呈时间依赖性上调，透射电镜下观察到紧密连接宽度减小[6]。舍格伦综合征患者唾液腺分泌功能低下，Claudin-1和Claudin-4从腺泡细胞顶端重新分布到基底外侧[7]，表明Claudin蛋白与紧密连接功能关系密切。因此，本文就目前唾液腺常见Claudin蛋白的相关研究进展进行综述。

Claudin是现阶段已知构成紧密连接最大的跨膜蛋白家族，哺乳动物中已发现27个成员，分子质量为20～27 ku。Claudin家族具有4个疏水跨膜结构域及多个磷酸化位点和结合区域，其N—端和C—端位于细胞质内，形成2个胞外环和1个胞内环[8]。Claudin蛋白根据序列可分为2组：①相似程度高的经典蛋白Claudin-1～10、14、15、17和19；
②非经典蛋白Claudin-11～13、16、18和20～24[9]。

Claudin蛋白广泛表达于各种上皮组织和内皮组织。Claudin-5主要表达于血管内皮组织，可影响其通透性，而流入下颌下腺的血流量增加是胆碱能诱导唾液分泌的基础条件[10]。Claudin-1广泛表达于上皮组织，敲除Claudin-1导致小鼠皮肤上皮对水和大分子物质的紧密连接屏障作用丧失，在出生后1 d内死于脱水[11]。目前，Claudin-1～12和16已在唾液腺中被检测到。

2.1 Claudin-1

Claudin-1广泛表达于各种鳞状上皮组织[12]。研究发现舌鳞状细胞癌患者体内Claudin-1在肿瘤病变中心为膜定位，病灶侵袭前缘则同时具有细胞内定位及膜定位，进一步比较发现Claudin-1高表达组中细胞内定位的颈淋巴转移率高于膜定位。因此，肿瘤侵袭前缘的细胞内定位模式可能是一种有价值的舌鳞状细胞癌诊断标志[13]。此外，多形性腺瘤、沃辛瘤、黏液表皮样癌、上皮性肌上皮瘤和涎腺导管癌的Claudin-1主要位于导管细胞膜，腺样囊性癌的Claudin-1主要位于紧密连接区[14]。上述结果表明Claudin-1分布位置可因肿瘤类型不同而发生变化。

Hollandsworth等[15]将Claudin-1抗体与IRDye800CW(一种近红外荧光素)结合，由尾静脉注入结肠癌裸鼠模型体内，无创性活体荧光成像后可清晰反映肿瘤边缘以及局部转移灶。由此提示Claudin-1可作为近红外抗体成像的有效靶点，用于肿瘤可视化，以便使用荧光引导进行手术治疗。

人、猪和小鼠下颌下腺的腺泡细胞和导管细胞中都发现有Claudin-1表达。该蛋白主要分布于浆液性腺泡细胞膜，在黏液性腺泡细胞的顶外侧膜上表达稍弱，此现象在人和猪的下颌下腺中较为相似。不同的是，小鼠下颌下腺的Claudin-1则主要分布于浆液性腺泡细胞的顶外侧膜和基底外侧膜上[16]，究其原因可能是啮齿类动物的颌下腺腺泡细胞类型多数为浆液性。Zhou等[17]发现糖尿病小鼠唾液腺分泌功能降低，阻断白介素(interleukins，IL)-17受体可上调Claudin-1的表达水平，改善唾液分泌以及炎性细胞浸润。

上述研究表明，Claudin-1不仅在唾液腺功能障碍中充当重要靶点，也是辅助诊治良恶性肿瘤的有效工具。

2.2 Claudin-2

Claudin-2主要表达于胆囊、肾脏和胃肠道[12]。在硫酸鱼精蛋白(protamine sulfate，PS)诱导的膀胱高渗性动物模型中，体内分子靶向磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)成像显示抗Claudin-2探针检出率明显高于假手术组[18]。由此可推测Claudin-2高表达与上皮通透性关系密切，并且Claudin-2抗体有望作为相关疾病分子标志物检测上皮通透性变化。

人下颌下腺和腮腺组织免疫组化显示Claudin-2分布于浆液性及黏液性腺泡细胞、夹层及横纹导管细胞，但在内皮细胞中并未发现[19]。然而，多项研究发现高糖水平、抗肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α治疗并未对Claudin-2产生明显影响[20-21]。

因此，Claudin-2在唾液腺功能的深层次机制仍需进一步探索。

2.3 Claudin-3

Claudin-3在胃肠道和一些腺体组织中表达[12]。与正常人相比，舍格伦综合征患者唾液腺中Claudin-3表达水平均降低，分布位置也从根尖质膜重新定位至基底外侧膜[7]。

多项研究表明Claudin-3与细胞通透性直接相关。在糖尿病小鼠下颌下腺及高糖处理的SMG-C6细胞系中，Claudin-3表达水平显著升高，细胞旁通透性降低，而基因敲除逆转了以上表型[20]。同时，免疫荧光图像显示Claudin-3主要定位于腺泡顶外侧和基底外侧膜，且相较于野生型小鼠染色增强。然而，两组小鼠的Claudin-3分布位置未见显著差异[20]。此外，SMG-C6细胞的Claudin-3可被TNF-α通过细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2选择性下调，跨上皮阻力下降，基因敲除改善了TNF-α导致的此种改变[22]。

此外，有研究表明小型猪副交感神经切除2个月后，静息唾液分泌量较对照组显著减少，Claudin-3表达水平降低，6个月后Claudin-3表达水平及唾液量均恢复至正常水平[23]。以上结果提示Claudin-3在切除副交感神经改善远期唾液腺分泌功能方面同样具有重要作用。

Claudin-3与前列腺癌的发生发展关系密切。Claudin-3是已知人前列腺癌细胞(PC3)数据库64种蛋白质中得分最高的蛋白，使用免疫胶体金标记技术证实了Claudin-3作为PC3外泌体表面蛋白的确切属性[24]。Martin等[25]发现高等级前列腺癌中Claudin-3表达水平更高，选取无毒截短的产气荚膜梭菌肠毒素片段设计功能化纳米颗粒，该靶向配体与Claudin-3受体有较强结合力，结合MRI成像可在体内实现肿瘤特异性粒子定位、分辨肿瘤侵袭性等功能。

2.4 Claudin-4

Claudin-4表达于多种组织的细胞膜，其中在胃肠道中表达最广泛[12]。哺乳动物下颌下腺的Claudin-4主要分布于导管上皮细胞外侧膜和基底膜。尽管腺泡细胞也表达Claudin-4，但主要集中于浆液性腺泡细胞膜，黏液性细胞分布较少[16]。

课题组前期研究表明电离辐射导致大鼠下颌下腺分泌功能降低，Claudin-4表达水平呈时间依赖性和辐射剂量依赖性上调，M3受体水平呈现相反趋势。缺血预处理和毛果芸香碱治疗后，Claudin-4表达水平降低，腺体分泌功能得到相应改善[26-27]。然而，毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcholine receptors，mAChRs)激活可通过ERK1/2下调Claudin-4，增加细胞旁通透性[28]。以上发现表明Claudin-4是mAChRs调节细胞旁通透性，从而改善唾液腺分泌功能所必需的。

对于唾液腺肿瘤，除黏液表皮样癌组织中Claudin-4水平与非唾液腺肿瘤相同外，多数肿瘤导管上皮细胞的Claudin-4水平增加，如基底细胞腺瘤、多形性腺瘤等。除腺样囊性癌外，Claudin-4荧光染色主要集中于肿瘤细胞膜，而非唾液腺肿瘤主要分布于紧密连接区[14]。此外，Claudin-4在胰腺癌中异常表达，注射[111In]Claudin-4抗体可利用单光子发射计算机断层成像(single-photon emission computed tomography，SPECT)对体内Claudin-4成像，作为早期检测胰腺癌的生物标记物[29]。上述结果显示，Claudin-4不仅有助于判断唾液腺肿瘤类型，而且是预测非唾液腺肿瘤的重要工具。

2.5 Claudin-5

Claudin-5是脑内皮细胞紧密连接的主要细胞黏附分子。敲除Claudin-5的小鼠由于血脑屏障严重受损，导致低于0.8 ku的示踪剂渗漏至脑和脊髓实质中，这些小鼠在出生后10 h内死亡[30]。低氧状态可诱导斑马鱼血脑屏障受损，免疫电镜下发现Claudin-5被小窝蛋白包裹，从细胞膜分布到细胞质并异常积聚。值得注意的是，自噬激活后对小窝蛋白的降解作用可抑制Claudin-5的异常改变，缓解了血脑屏障的损伤程度[31]。

在所有Claudin蛋白中，Claudin-5是许多类型内皮细胞中表达最丰富的内皮特异性封闭紧密连接成分[32]。舍格伦综合征患者唇腺和双侧腮腺组织的Claudin-5水平较正常人升高，分布位置由内皮细胞最顶端重新定位至内皮细胞的细胞质[33]。此外，糖尿病小鼠下颌下腺的Claudin-5表达模式同样异常。7周龄时Claudin-5 mRNA水平增加不明显，定位于相邻内皮细胞的最内侧。12周龄时Claudin-5表达于相邻内皮细胞侧膜和细胞质，其mRNA水平较对照组小鼠显著上调，同时淋巴细胞浸润及紧密连接宽度增加[33]。因此，炎性环境可能导致Claudin-5的表达和定位异常，从而出现紧密连接内皮屏障破坏。

唾液腺黏液表皮样癌的Claudin-5 mRNA水平显著高于正常组，广泛分布于肿瘤岛表皮细胞的细胞质和细胞膜，进一步分析发现Claudin-5的高表达水平对肿瘤的自我维持能力有一定程度的影响[34]。

2.6 Claudin-6

Claudin-6高表达于胎盘和睾丸[12]。过度表达Claudin-6的转基因小鼠由于缺乏完整的表皮通透性屏障，跨表皮水分流失明显增加，导致小鼠在出生后48 h内死亡[35]。

小鼠下颌下腺Claudin-6主要在胚胎16 d表达于导管顶端并集中于紧密连接处，但在出生后几乎完全消失[36]。上述结果与该分子在其他器官的胚胎特异性表达类似。Claudin-6定位于新生小鼠肾脏近端小管顶端细胞间连接处、升支粗段、远端小管及集合管，表达水平随年龄增加而下降，而成年小鼠肾脏几乎检测不到Claudin-6[37]。Zhao等[38]发现正常肾脏肾小球Claudin-6沿毛细血管壁分布，与ZO-1共定位。免疫电镜显示Claudin-6金颗粒主要积聚在基底细胞膜，少数分布于裂孔隔膜和紧密细胞连接处。PS灌注肾脏后，Claudin-6免疫金颗粒重新分布至足细胞足突间新形成的细胞接触部位。由此可推断Claudin-6是肾脏发育过程及病理条件下严重影响紧密连接的跨膜蛋白。

这些研究表明，Claudin-6可能在干细胞分化中有重要作用，未来应探索Claudin-6在唾液腺发育的具体机制。

2.7 Claudin-7

Claudin-7蛋白表达于多数腺泡细胞，其mRNA在胃中高表达[12]。敲除Claudin-7的小鼠体内钠、氯和钾离子严重流失，出现尿盐消耗、脱水及生长缓慢，在出生后12 d死亡[39]。

激光共聚焦显微镜扫描创建三维图像后显示小鼠和人下颌下腺腺泡细胞的外侧膜和基底膜可观察到Claudin-7，但在猪下颌下腺的腺泡细胞中未检测到。同Claudin-1和Claudin-4表达模式类似，Claudin-7定位于人、猪和小鼠下颌下腺导管细胞的外侧膜和基底膜，不同的是，小鼠腺体导管细胞染色较腺泡细胞强烈[16]。

对于唾液腺肿瘤，Aoyama等[14]发现基底细胞腺癌和腺样囊性癌导管上皮细胞的Claudin-7定位于紧密连接区和细胞膜，免疫反应性明显高于非肿瘤组织。对于唾液腺肿瘤的基底样/肌上皮细胞细胞膜，Claudin-7在肌上皮瘤、沃辛瘤和肌上皮癌表达更显著。因此，不同类型唾液腺肿瘤的Claudin-7定位差异有望作为判断肿瘤类型的特异性标志。

2.8 Claudin-8

Claudin-8在哺乳动物的肾脏、前列腺、乳腺、膀胱、味蕾、骨骼肌和皮肤都有表达[40]。该蛋白主要定位于细胞膜，与细胞黏附的紧密连接关系密切。与正常人基因数据库比较，口腔鳞状细胞癌患者组织Claudin-8表达水平下调，表明Claudin-8可能具有抑癌作用。然而，Claudin-8高表达的口腔鳞状细胞癌患者总体生存率较低，表明Claudin-8可能促进口腔鳞状细胞癌的进展[41]。因此，Claudin-8在口腔鳞状细胞癌发生发展的不同阶段发挥的作用可能完全相反。尽管该蛋白可能作为口腔鳞状细胞癌总体生存预后的标志物，但其在口腔鳞状细胞癌中的作用亟需解释。

目前，Claudin-8在小鼠、猪和人下颌下腺中被检测到[16]，然而，需要进一步研究确定其在唾液腺中的功能。

2.9 Claudin-10

Claudin-10在多种组织中呈现高表达，例如唾液腺、肾小管、外分泌胰腺和胆囊[12]。研究表明Claudin-10序列变异与人类螺旋综合征(少汗症、电解质失衡、泪腺功能障碍、鱼鳞症和口干症)关系密切。Sewerin等[42]使用黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)分别标记Claudin-10a G163A与Claudin-10b G165A。发现Claudin-10a G163A与野生型(wild type，WT)共同定位于细胞间接触部位。相反的是，Claudin-10b WT定位于细胞间接触部位， Claudin-10b G165A则分布于相邻细胞膜，表明Claudin-10b反式相互作用受到抑制。由此推断， Claudin-10a G163A和Claudin-10b G165A双等位基因突变，导致基于缺陷Claudin-10紧密连接链引起的螺旋综合征变异，并且Claudin-10b受累更严重。

小鼠下颌下腺中Claudin-10在胚胎16 d及出生后明显表达，主要定位于末端小管，与ZO-1共定位[36]。然而，糖尿病小鼠下颌下腺组织Claudin-10 表达水平与对照组相比未见明显差异，腮腺组织中却观察到明显下调[43]。同时，IgG4相关涎腺炎患者唾液分泌减少，下颌下腺Claudin-10 mRNA水平下调[44]。

综上所述，Claudin-10在唾液、汗液和泪液分泌中发挥重要作用，并且在不同的唾液腺疾病及组织类型中表达水平有所差异，其中机制需进一步探索。

2.10 Claudin-11

Claudin-11大量表达于睾丸的支持细胞以及中枢神经系统的少突胶质细胞[12]，在多种屏障中发挥重要作用。Uchida等[45]发现多发性硬化症的血-脑屏障(blood-brain barrier，BBB)、血-脊髓屏障(blood-spinal cord barrier，BSCB)和血-蛛网膜屏障(blood-arachnoid barrier，BAB)中，Claudin-11蛋白表达水平显著下调，降低了中枢神经系统内皮和上皮屏障的完整性。因此，预防Claudin-11下调可能作为治疗多发性硬化症的一种有效策略。

类似于Claudin-10的表达模式，Claudin-11可在胚胎16 d和出生后的小鼠下颌下腺末端小管表达。不同的是，该分子似乎也表达于邻近末端小管的导管区域[36]。Cong等[46]发现兔下颌下腺自体移植后Claudin-11 mRNA表达下调，使用辣椒素可激活香草酸受体亚型1，Claudin-11 mRNA呈时间依赖性恢复，同时唾液流量显著增加。因此，Claudin-11可能与唾液腺发育及屏障功能关系密切，确定该蛋白具体功能的研究很有必要。

2.11 Claudin-12

Claudin-12是非典型的Claudin蛋白[9]。Dias等[47]表明Claudin-12表达于小鼠多个器官，包括肝脏、心脏、肾脏、肠、骨骼肌、舌头、视网膜和大脑。此外，炎症刺激下未观察到中枢神经系统的Claudin-12表达上调，其缺失不会损害血脑屏障的完整性及加重实验性自身免疫性脑脊髓炎的程度。由此推断Claudin-12对维持血脑屏障完整性不是必需的。

与健康小鼠相比，舍格伦综合征小鼠下颌下腺中Claudin-12 mRNA表达上调[48]。相反的是，IgG4相关涎腺炎患者下颌下腺Claudin-12 mRNA显著下调[44]。综上所述，Claudin-12参与多种屏障组成，其表达模式在不同类型的涎腺疾病中也存在差异。因此，未来有必要了解Claudin-12在唾液腺中的作用。

2.12 Claudin-16

在人类大唾液腺中，Claudin-16表达于腺泡的基底外极和导管的顶端区，该蛋白在导管中的分布位置表明其在钙和镁转运中起重要作用[49]。因此，需要进一步探索Claudin-16对导管功能的意义，以及确定其在腺泡中的潜在作用。

紧密连接蛋白Claudin亚型的表达模式和功能各有不同，不同的唾液腺疾病中也各有差异。本文介绍了唾液腺常见Claudin蛋白在放射性损伤、炎症性疾病、舍格伦综合征和糖尿病等多种病理状况下的研究，未来应探索该蛋白家族在不同疾病中的深层次机制。此外，Claudin蛋白不仅作为口腔及唾液腺肿瘤的生物标志物，还可特异性靶向标记如胰腺癌、结肠癌等其他器官肿瘤，实现肿瘤可视化，对肿瘤诊断、分型和预后等提供新思路，为实现个性化治疗和精准治疗阐明理论依据。