大黄灵仙方对胆固醇结石豚鼠模型胆囊Cajal间质细胞中scf/c-kit信号通路的影响

肖丽君， 甘苡榕， 刘春丽， 李承积， 杨 文， 庞浇安， 滕金豪， 俞 渊

1 广西中医药大学 研究生学院， 南宁 530001；

2 广西中医药大学第一附属医院 肝胆外科， 南宁 530023

胆囊胆固醇结石(cholesterol gallstone，CG)是外科临床上的常见病、多发病。据统计，其在西方成年人群中的发病率为10%～15%[1]，在我国的发病率为4.42%～11%[2]。CG成因复杂，主要包括胆汁胆固醇过饱和、胆汁中促/抗成核因子平衡破坏、胆固醇单水结晶析出及胆囊动力功能障碍等，其中胆囊动力功能障碍是导致CG形成的关键因素[3]。目前已有大量研究表明，胆囊动力下降、胆固醇结石形成均与Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)及其内部的干细胞生长因子/酪氨酸激酶受体(scf/c-kit)信号通路有关，彭雅亚等[4]研究发现CG发病过程中胆囊动力学的减弱与ICC有一定关联；
赵健楠等[5]通过归纳总结大量文献后亦发现ICC的丢失、起搏电位减弱及对胆囊收缩素反应性降低等功能障碍均可能促进CG形成，且其发生机制可能与scf/c-kit信号通路抑制有关；
许金煌等[6]通过将不同质量浓度的胆固醇培养液作用于体外分离培养的豚鼠胆囊ICC中，发现高浓度的胆固醇环境通过抑制scf/c-kit信号通路影响胆囊ICC的生长发育，并促使其凋亡增加，进而引起胆囊ICC总数量的减少，导致胆囊的自发节律收缩功能下降，从而在CG形成过程中发挥作用。

大黄灵仙方是唐乾利老师总结多年临床经验创制的治疗胆石症的有效复方，其团队也通过实验证实了大黄灵仙方的确切疗效，如通过调控NF-κB信号通路抑制胆管细胞炎性反应阻止胆石症的发生[7]、通过调节胆管内皮细胞TGFβ1mRNA、Smad2/3mRNA表达减少胆石症的复发率[8]等。基于上述研究，笔者参考Feng等[9]的实验方法，通过高胆固醇浓度对胆囊ICC损伤模型的构建，探讨大黄灵仙方是否能通过调控胆囊ICC中scf/c-kit信号通路影响胆囊动力功能，进而达到减少CG发生及复发的目的。

1.1 实验动物 选用SPF级健康雄性豚鼠45只，体质量219.7～290.4 g，购买于广西广得生物科技有限公司(实验动物生产许可证编号：scxk桂2017-0001；
实验动物使用许可证编号：0009675)。所有豚鼠饲养于广西中医药大学第一附属医院动物房，动物房温度恒定18～24 ℃，相对湿度50%～60%，豚鼠适应性喂养1周后开始实验。

1.2 药品与试剂 大黄灵仙方组成：生大黄15 g、威灵仙30 g、芒硝10 g、金钱草30 g、枳壳12 g、鸡内金12 g、泽兰15 g、柴胡12 g、郁金12 g、磁石10 g、黄芪30 g、炙甘草5 g，经广西中医药大学第一附属医院药剂科按相等剂量换算配为颗粒剂，所有中药颗粒剂均由江阴天江药业有限公司提供，均为同一批号；
无水乙醇、二甲苯、正丁醇、3%双氧水、中性树胶(国药集团化学试剂有限公司，货号分别为100092683、10023418、100052190、10011208、10004160)；
柠檬酸(pH=6.0)抗原修复液、PBS缓冲液、4%多聚甲醛、BSA、正常兔血清、苏木素染液、苏木素分化液、苏木素返蓝液、组化试剂盒DAB显色剂(武汉赛维尔生物科技有限公司，货号分别为G1202、G0002、G1101、G5001、G1209、G1004、G1309、G1340、G1211)；
细胞裂解液、甘氨酸、脱脂乳、TBST缓冲液(Solarbio公司，货号分别为R0020、G8200.316y065、414W052、T1082)；
5×蛋白上样缓冲液(Biosharp公司，货号Cat.No.TY-201-T20B/20210830)；
ECL底物液(Beyotime公司，货号P00185)。

1.3 仪器 PVDF膜(Sigma公司，型号ISEQ00010)；
包埋机、冻台(武汉俊杰电子有限公司，型号分别为JB-P5、JB-L5)；
病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016)；
组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-P)；
烤箱(上海慧泰仪器制造有限公司，型号DHG-9140A)；
免疫组化笔(武汉赛维尔生物科技有限公司，型号为WG1066-1)；
移液枪(Dragon公司，型号KE0003087/KA0056573)；
显微镜(Nikon公司，型号E100)；
成像系统(日本尼康，型号Nikon DS-U3)。

2.1 实验分组及造模 将45只豚鼠随机分为3组，正常组、模型组、中药组各15只，其中正常组予正常饲料喂养，模型组、中药组予高脂致石饲料(由上海成大饲料有限公司提供，组成为：82.5%普通饲料+15%脂肪+2%胆固醇+0.5%胆酸)喂养，喂养8周后分别从各组中随机抽取5只豚鼠，其中模型组、中药组在肉眼观察下结石形成超过4只，则判断为模型建立成功。

2.2 给药方法及剂量选择 造模结束后开始灌胃给药，中药用量参照《中药药理学实验方法学》[10]按实验动物与人体药物等效剂量换算公式计算，豚鼠的给药剂量为：X mg/kg×70 kg×0.031/400 g=X mg/kg×70 kg×0.031/0.4 kg=5.42 X mg/kg，最终确定大黄灵仙方给药剂量为2 mL/100 g。中药组予大黄灵仙方中药灌胃，模型组予等体积生理盐水灌胃，正常组不予特殊干预；
每日给药1次，连续灌胃给药8周后对豚鼠胆囊进行取材。

2.3 实验方法及步骤

2.3.1 HE染色检测胆囊病理学改变 将蜡块切成5 μm厚的切片，经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后，予苏木精-伊红(HE)染色，以中性树胶进行固定封片，进行图像采集，观察胆囊组织的病理性改变。

2.3.2 免疫组化检测胆囊组织TNFα、scf、c-kit蛋白表达变化 将豚鼠胆囊平滑肌组织固定在4%聚甲醛溶液中，并包埋在石蜡中，制成4 μm厚的切片，经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，阻断内源性过氧化物酶及加热抗原修复后，用正常兔血清在室温下封闭30 min，加入一抗，置于湿盒内4 ℃孵育过夜；
PBS漂洗后加入二抗，室温下孵育50 min；
PBS漂洗后DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。采用Image Pro Plus测量出每张图片的累积光密度值(integrated option density，IOD)以及区域面积 area值，再计算出平均光密度值(mean density)=IOD/area，最后取每个样本的5个随机区域的平均光密度值作为该样本目的蛋白的值。

2.3.3 Western blot检测胆囊组织TNFα表达 取液氮冻存的豚鼠胆囊组织，经粉碎、裂解、离心后提取蛋白上清液，将提取的蛋白与5×蛋白上样缓冲液混合均匀后煮沸10 min使蛋白变性，检测蛋白浓度，计算上样体积；
经梯度电泳后转印至PVDF膜上；
5%脱脂乳室温下封闭1 h；
4 ℃过夜孵育一抗，常温孵育二抗1 h，TBST缓冲液洗涤3次后，采用ECL进行化学发光反应，于凝胶成像仪下拍照，获取图片。

3.1 各组豚鼠体质量的变化情况 经过8周喂养，正常组豚鼠体质量增长最低，中药组次之，模型组最高(图1)。

图1 豚鼠体质量的变化情况

3.2 各组豚鼠胆囊组织的病理HE染色情况 正常组豚鼠胆囊组织结构完整，胆囊黏膜表面的单层柱状上皮细胞排列整齐、紧密，无异常增生，无明显炎性细胞浸润；
模型组豚鼠胆囊组织黏膜水肿、增厚，单层柱状上皮细胞排列紊乱，黏膜层和肌层中大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主；
中药组豚鼠胆囊黏膜表面的单层柱状上皮细胞排列整齐，黏膜未见明显增厚，炎性细胞浸润较模型组减轻(图2)。

注：a，正常组；
b，模型组；
c，中药组。

3.3 各组豚鼠胆囊组织中TNFα的表达情况 Western blot实验、免疫组化实验结果均显示，在豚鼠胆囊组织中，与正常组相比，模型组TNFα的表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；
与模型组相比，中药组TNFα的表达水平呈降低趋势，差异有统计学意义(P<0.05)(图3～5，表1)。

图3 大黄灵仙方干预下TNFα的表达情况

图4 大黄灵仙方对TNFα表达水平的影响

3.4 各组豚鼠胆囊平滑肌组织中scf、c-kit的表达情况 免疫组化实验结果显示，与正常组相比，模型组、中药组豚鼠胆囊平滑肌组织中scf、c-kit的表达水平均下降(P值均<0.05)；
与模型组相比，中药组豚鼠胆囊平滑肌组织中scf、c-kit的表达水平呈上升趋势，且差异均有统计学意义(P值均<0.05)(图5，表1)。

图5 大黄灵仙方干预下TNF、scf、c-kit的表达情况(免疫组化，×100)

表1 大黄灵仙方对TNFα、scf、c-kit表达水平的影响

胆囊收缩功能下降是胆囊结石形成的重要原因，胆囊ICC减少对胆囊收缩功能的影响也起到了至关重要的作用。ICC是1893年西班牙神经解剖学家圣地亚哥·拉蒙·卡哈尔发现的分布在消化道自主神经末梢和平滑肌细胞之间的一类特殊细胞，特异性表达3型酪氨酸激酶生长因子受体c-kit，主要参与消化道基本电节律的产生和调控，对维持消化道正常运动功能起决定性作用[11]。2000年，Ortiz-Hidalgo等[12]发现胆囊间质瘤细胞的表型与ICC相似；
2007年，Lavoie等[13]在豚鼠胆囊中发现了ICC；
2012年，Pasternak等[14]在人体胆囊组织中发现了ICC，并认为其与胆囊产生和传播自发性节律有关。

在胆囊中，ICC存在于固有肌层和上皮下结缔组织层，通过缝隙连接和c-kit与胆囊平滑肌细胞形成电耦合，并参与胆囊固有肌层自发节律性电活动的产生和起搏[13]。其产生机制为：胆囊ICC通过自发的细胞内钙振荡产生慢波(slow wave，SW)电位，SW电位通过上述ICC网络传播至与之相连的平滑肌细胞，刺激并调节平滑肌活动[15]。研究表明，ICC具有高度的可塑性[16-18]和再生能力[19]。其特异性标志物为c-kit，表达于ICC的质膜上[20]，可以编码kit。scf是c-kit受体的天然配体，c-kit及scf组成的scf/c-kit信号通路在ICC的发育、分化及表型维持中起重要作用[21]，当c-kit受体被scf激活后，两分子c-kit与两分子scf在胞外结构域1～3区分别进行结合，进而引起c-kit的二聚化，激活细胞内酪氨酸激酶，导致酪氨酸自动磷酸化，启动MAP激酶和JAK/STAT信号转导途径导致细胞分化和增殖[22]。而当scf/c-kit信号通路受损时，c-kit及其mRNA表达下降，可引起ICC数量、形态及功能异常。

研究[23-24]表明，当胆囊内胆固醇浓度增高时，氧自由基系统被激活，释放大量活性氧，引起胆囊组织发生氧化应激反应，使ICC发生凋亡，导致其数量减少，胆囊收缩功能下降，胆汁不能及时排出，胆汁过饱和而致胆固醇结晶析出，形成胆囊结石；
除此之外，胆囊壁的长期慢性炎症浸润可引起TNFα的释放，而TNFα的释放可激发TNFα/胱天蛋白酶8/胱天蛋白酶3的级联反应，进而诱导ICC凋亡[25]。

中医药对胆石症的治疗由来已久，许多临床实践及实验也证实了其在缓解患者临床症状、溶石排石及改善血清学指标等方面具有确切的疗效。大黄灵仙方是唐乾利老师总结十多年临床经验创制的目前仍在应用的有效中药复方，该方以疏肝利胆、攻下排石为立方原则，全方由生大黄、威灵仙、芒硝、金钱草、枳壳、鸡内金、泽兰、柴胡、郁金、磁石、黄芪、炙甘草等药物组成，临床上常用于胆石症的治疗。现代药理学研究发现该方中的威灵仙、金钱草、郁金等中药具有促进胆囊收缩的作用，结合胆囊动力功能障碍是导致胆固醇结石形成的关键因素的论点，为探索其发挥作用的机制，笔者通过阅读大量文献后猜测其可能与胆囊ICC及其内部的scf/c-kit信号通路有关，为了进一步验证，课题组通过观察各组豚鼠胆囊病理情况并且应用Western blot及免疫组化检测二者之间的关系。病理结果显示，正常组豚鼠胆囊组织结构完整，无明显炎性细胞浸润；
模型组胆囊组织可见水肿、增厚、细胞排列紊乱及大量炎性细胞浸润；
中药组胆囊组织内炎性细胞浸润程度较模型组明显减轻，表明大黄灵仙方有助减轻胆囊组织病理损伤。Western blot结果显示，在豚鼠胆囊组织中，相较于模型组，中药组TNFα的表达量呈降低趋势，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明大黄灵仙方能减轻胆囊组织炎症反应。免疫组化结果显示，与模型组相比，中药组豚鼠胆囊平滑肌组织中scf、c-kit的表达量呈上升趋势，差异均具有统计学意义(P值均<0.05)，表明大黄灵仙方可以促进scf、c-kit蛋白的活化从而增强胆囊收缩功能。

综上所述，大黄灵仙方可以通过下调TNFα的表达水平，减轻炎症反应，从而减轻ICC的凋亡；
可以通过上调scf、c-kit的表达水平诱导ICC分化和增殖，增加ICC的数量，进而增强胆囊动力功能，最终达到减少胆囊胆固醇结石发生及术后复发的目的。

伦理学声明：本研究方案于2021年5月25日经由广西中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会审批，批号：DW20191017-023，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：肖丽君负责课题设计，资料分析，拟定写作思路，撰写论文；
甘苡榕参与资料分析，修改论文；
刘春丽、李承积、杨文、庞浇安、滕金豪负责文献检索，收集数据及数据统计分析；
俞渊负责指导撰写文章并最后定稿。