气相色谱-电子捕获检测器分析葡萄酒中的8种生物胺

杨 静，王 琨，周 元

（1.杨凌质量技术检测检验所，陕西 杨凌 712100；
2.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

生物胺是一类含有胺基的有机物的统称，常见的生物胺类型包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、β-苯乙胺、组胺和色胺[1]。生物胺在葡萄酒中普遍存在，主要由具有氨基酸脱羧酶活性的微生物对游离氨基酸的脱羧作用产生。摄入过量生物胺会对机体产生神经毒性，典型症状为头疼、心悸、呕吐、血压升高、呼吸紊乱等[2]，因此，葡萄酒中生物胺的定量分析已成为食品安全研究的一项重要内容。在上述8种生物胺中，组胺和酪胺的毒性最强[3]，并且乙醇会加剧其毒性作用[4]，因此澳大利亚、法国和德国已分别对葡萄酒中的组胺含量制定了10mg/L、8mg/L和2mg/L的限量值要求[5]，而我国目前还尚未对葡萄酒中的生物胺做出限量要求。

由于葡萄酒中生物胺检测的重要性，目前研究者已经开发了多种技术手段用于分析葡萄酒中生物胺的方法，其主要可以分为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[6-8]和液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[9-11]两大类。液相色谱-质谱联用法分析生物胺时不需要对样品进行衍生，具有简单和快速的技术优势，但设备昂贵，普及率不高，并且基质效应常对定量产生干扰[10-11]。相比之下，高效液相色谱法的使用频次最高，国标GB 5009.208—2016《食品中生物胺的测定》同样采用该方法对食品中的生物胺水平进行分析[12]。由于部分生物胺（主要是脂肪族生物胺）具有极低的紫外或荧光响应，通常需要采用丹磺酰氯[13]和芴甲氧羰酰氯[14]等衍生剂对其进行衍生，以增强其在紫外或荧光检测器上的信号响应。葡萄酒中含有多种游离氨基酸，其同样会与上述衍生剂反应，从而产生大量潜在干扰液相色谱分离的新色谱峰。为了降低干扰，衍生后的样品在进行液相色谱分析之前通常还需要进行进一步的净化处理，这延长了分析时间，增加了方法的复杂性[12-13]。气相色谱-电子捕获检测器（gas chromatography-electron capture detector，GC-ECD）分析具有高灵敏度，并且对电负性物质（特别是含卤族元素的有机物）具有高选择性，但将其用于发酵食品中生物胺分析的研究还未见报道。

本研究建立了气相色谱-电子捕获检测器分析葡萄酒中生物胺的方法。该方法对葡萄酒中的生物胺同时进行了提取和衍生，对生物胺提取和衍生溶剂的种类、衍生剂用量、催化剂种类及添加量条件进行优化，并采用GC-ECD对生物胺进行分析，以期使葡萄酒中生物胺的分析更加简便易行，为含有复杂基质的液态发酵食品中生物胺的分析提供解决方案。

1.1 材料与试剂

干红葡萄酒：中国、澳大利亚品牌各2个；
从每个品牌葡萄酒中取样100 mL，振荡混合，作为测试样品，于4 ℃冷藏待用。

腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、β-苯乙胺、组胺和色胺的盐酸盐、氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯、吡啶、三乙胺（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
乙酸乙酯、二氯甲烷（均为色谱纯）：美国TEDIA公司。

1.2 仪器与设备

GC2014气相色谱仪：日本岛津公司；
Vortex-Genie2漩涡混合器：美国Scientific Industries公司；
N-EVAP-34氮吹仪：美国Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 生物胺钠盐标准溶液的配制

单标储备液的配制：将上述8种生物胺的盐酸盐分别溶解在超纯水中，配成终浓度为4 mmol/L的单标溶液。

混标储备液的配制：从每种单标溶液中吸取10 mL溶液，加入至100 mL容量瓶中，用超纯水定容，即配成单标浓度为0.4 mmol/L的混标储备液。

混标工作溶液的配制：用超纯水按比例依次稀释混标储备液，即制备成单标浓度分别为200 μmol/L、100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L、10 μmol/L、5 μmol/L和1 μmol/L的生物胺混标工作溶液。

1.3.2 生物胺提取衍生条件及其优化

提取衍生条件：取0.5 mL混标工作溶液或葡萄酒样品，加入5 mL玻璃具塞试管内，再加入0.5 mL 0.2 mol/L碳酸钠溶液将pH调至约11.8（将有机相中的离子态生物胺转化为质子态，促进其向有机相中转移），随后加入4 mL二氯甲烷（作为生物胺的提取溶剂和衍生反应的有机相）、20 μL氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯（作为生物胺的衍生剂）和10 μL的三乙胺（作为衍生反应的催化剂），旋涡混匀，于40 ℃反应10 min，吸取1 mL有机相进行气相色谱分析。

提取衍生条件的优化：分别考察有机溶剂种类（二氯甲烷、乙酸乙酯）、衍生剂添加量（10 μL、20 μL、30 μL）、催化剂的种类（吡啶、三乙胺）以及催化剂添加量（5 μL、10 μL、15 μL）对衍生产物生成的影响，以确定最佳的衍生条件。

1.3.3 气相色谱分析

气相色谱条件：进样口温度280 ℃，进样体积为1 μL；
分流比10∶1；
色谱柱：HP-5非极性石英毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；
柱流量1.8 mL/min；
程序升温为初始温度120 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至270 ℃，保持1 min；
电子捕获检测器，温度300 ℃，尾吹气为氮气（N2），N2流量30 mL/min。

定性、定量分析：根据保留时间对特定生物胺的衍生物进行定性分析。采用峰面积外标法对样品中的生物胺进行定量分析。设对照组的峰面积为100%，试验组峰面积与其比值为试验组的相对峰面积。

1.3.4 方法学评价

灵敏度试验：将生物胺混标溶液依次进行2倍稀释，然后进行色谱分析，选取峰高约为基线噪音10倍的色谱峰，计算信噪比。依据信噪比3和10分别计算目标物的检出限（limitofdetection，LOD）和定量限（limitofquantitation，LOQ）。

加标回收率试验：分别向已知含量的同一葡萄酒样品中添加1 mol/L、10 mol/L和100 mol/L的生物胺标准品，按照1.3.2和1.3.3的方法进行衍生和气相色谱分析，计算各成分的加标回收率。

精密度试验：取葡萄酒混合样品，配制8组不同质量浓度的生物胺溶液，每组浓度分别做6个平行样，按照1.3.2和1.3.3的方法进行衍生和气相色谱分析，记录峰面积，每个样品平行测定3次，取3次测定结果的平均值，并计算精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 数据处理

所有试验均重复3次，使用统计软件SPSS 18.0对数据进行统计分析。采用一维方差分析进行组间差异性分析，多重比较选用Duncan法。P＜0.05认为组间存在差异性差异。

2.1 8种生物胺混合标准品衍生物的气相色谱图

8种生物胺混合标准品衍生物的气相色谱图见图1。由图1可知，8种生物胺的衍生物在HP-5毛细管色谱柱上可以很好地分离，保留时间由低至高依次为β-苯乙胺、组胺、亚精胺、色胺、腐胺、尸胺、酪胺和精胺的衍生物。各种生物胺衍生物彼此间都实现了基线分离。由于生物胺的极性基团（伯胺基或仲胺基）在衍生反应后被封闭，因此衍生物相对于前体物具有更低极性，这保证了其在非极性毛细管色谱柱上能呈现出尖锐对称、无明显前沿和拖尾的色谱峰形，为目标物色谱峰的分离和准确定量提供了技术保障。

图1 8种生物胺混合标准品衍生物的气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of derivatives of biogenic amine mixed standards

由于精胺有4个胺基与衍生剂发生了酰胺化反应，这致使衍生物的分子质量和沸点远高于前体物精胺，极性也远低于精胺，因而其在非极性毛细管色谱柱上的保留时间也更长。β-苯乙胺只含有1个伯胺基，其对应的衍生产物的分子质量和沸点较低、极性较大，故而其保留时间最短。

2.2 生物胺衍生条件的优化

2.2.1 衍生剂添加量

氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯在有机合成过程中常被用作胺基基团的保护试剂[14]，在分析化学领域用于气相色谱法或气相色谱质谱联用法分析麻黄碱和苯丙胺类药物[15-16]。为了使衍生反应能够进行得更彻底，通常衍生剂的用量都应该在理论用量的10倍以上。衍生剂添加量对生物胺衍生物相对峰面积的影响见图2。由图2可知，当5 mL体系中衍生剂添加量为10～30 μL时，β-苯乙胺、腐胺、尸胺衍生物的相对峰面积差异不显著（P＞0.05）。当衍生剂添加量为10～20 μL时，组胺、亚精胺、色胺、酪胺和精胺的相对峰面积显著增加（P＜0.05）；
当衍生剂添加量为20 μL时，β-苯乙胺、组胺、亚精胺、色胺、腐胺、酪胺、尸胺和精胺衍生物的相对峰面积分别为98.5%、98.2%、115.1%、113.3%、98.2%、110.1%、122.2%和130.2%；
当衍生剂添加量为20～30 μL，相对峰面积变化不显著（P＞0.05）。由此可见，20 μL的衍生剂添加量已经能够保证衍生反应进行至最大化，因此5 mL体系中最优的衍生剂添加量为20 μL。

图2 衍生剂用量对生物胺衍生物相对峰面积的影响Fig.2 Effect of derivative addition on relative peak area of biogenic amine derivatives

2.2.2 催化剂类型及添加量

由于吡啶和三乙胺是酰胺化反应过程中常用的缚酸剂和催化剂[17-18]，吡啶和三乙胺因其氮原子上含有未共用电子对可接受质子而显碱性。吡啶的共轭酸的pKa数值约为5.2，而三乙胺的pKa数值则约为10.7[19]，由此可见，三乙胺的碱性更强。催化剂种类及添加量对生物胺衍生物生成的影响见图3。

图3 催化剂种类和添加量对生物胺衍生物相对峰面积的影响Fig.3 Effect of catalyst type and addition on relative peak area of biogenic amine derivatives

由图3可知，当催化剂为吡啶时，5 mL体系中吡啶添加量为5～15 μL时，β-苯乙胺、组胺、亚精胺、腐胺、酪胺、尸胺和精胺衍生物的相对峰面积差异不显著（P＞0.05）。吡啶添加量为5～10 μL时，色胺衍生物的相对峰面积逐渐增加；
吡啶添加量为10 μL时，色胺衍生物的相对峰面积达到最大值；
吡啶添加量为10～15 μL时，色胺衍生物的相对峰面积逐渐下降。吡啶添加量为10 μL时，β-苯乙胺、组胺、亚精胺、色胺、腐胺、酪胺、尸胺和精胺衍生物的相对峰面积分别是对照组的1.02、1.60、0.98、2.22、1.10、1.02、0.94和1.08倍。因此，吡啶最佳添加量为10 μL。

当催化剂为三乙胺时，添加量为5～15 μL时，β-苯乙胺、亚精胺、腐胺、酪胺、尸胺和精胺的衍生物相对峰面积差异不显著（P＞0.05）。吡啶添加量为5～10 μL时，组胺、色胺衍生物的相对峰面积逐渐增加；
吡啶添加量为10 μL时，组胺、色胺衍生物的相对峰面积达到最大值；
三乙胺添加量为10～15 μL时，色胺衍生物的相对峰面积逐渐下降三乙胺添加量为10 μL时，β-苯乙胺、组胺、亚精胺、色胺、腐胺、酪胺、尸胺和精胺衍生物的相对峰面积分别是对照组的1.74、12.00、1.48、15.22、1.85、2.46、1.48和1.85倍。综合考虑，三乙胺为最佳催化剂，最优添加量为10 μL。

2.2.3 提取和衍生溶剂有机相

乙酸乙酯已经用于酒类产品中生物胺的提取，并且对其中的生物胺起到了较好的提取效果[20-21]，此外，二氯甲烷也已用于酱油[22]和中药提取液[23-24]中生物胺的提取，同样显示了较高的提取率。二氯甲烷对生物胺衍生物相对峰面积的影响见图4。

图4 二氯甲烷和乙酸乙酯对生物胺衍生物相对峰面积的影响Fig.4 Effect of methylene dichloride and ethyl acetate on relative peak area of biogenic amine derivatives

由图4可知，二氯甲烷比乙酸乙酯更适合作为生物胺的提取和衍生溶剂有机相。使用二氯甲烷作为溶剂时，β-苯乙胺、组胺、亚精胺、色胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺衍生物的相对峰面积分别是乙酸乙酯作为溶剂时的8.0、12.1、4.8、11.2、3.6、5.0、10.3和4.2倍。由此可见，在促进芳香族生物胺（β-苯乙胺和酪胺）和杂环生物胺（组胺和色胺）衍生物产生方面，二氯甲烷的作用更为突出。因此，选择二氯甲烷为最佳提取和衍生溶剂有机相。

综上所述，试验确定的衍生剂（氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯）添加量为20 μL；
最佳催化剂为三乙胺，添加量为10 μL；
最佳提取和衍生溶剂有机相为二氯甲烷。碳酸钠溶液碱化样品溶液，促进了水相中生物胺的质子化，从而使其更容易脱离水相而进入有机相。在有机相中，生物胺与衍生剂发生了酰胺化反应，从而导致有机相中生物胺浓度不断下降，这会导致水相中的生物胺持续进入有机相而被衍生，该过程循环往复，使同时提取和衍生生物胺变成可能。氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯是一类活泼的胺基衍生剂，即便在室温条件下，其也可以与胺基化合物迅速反应[25]。衍生试剂与有机物的伯胺基和仲胺基均能反应，且反应过程迅速，反应条件温和，通常在室温下反应10 min即可达到最大产率[26]。这是因为水相中的质子化的生物胺向有机相转移需要时间。乙酸乙酯和二氯甲烷作为酰胺化衍生反应的溶剂时，在衍生物产量上的差异应该与酰卤和生物胺发生缩合反应的特性有关[27]。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性关系试验考察

电子捕获检测器是灵敏度最高的气相色谱检测器，同时又是最早出现的选择性色谱检测器。它仅对那些能捕获电子的化合物，如卤代物、含N、O和S等杂原子的化合物有响应，特别是对含卤族元素的化合物有极高响应[28]。8种生物胺的标准曲线回归方程、线性范围、检出限和定量限见表1。

表1 8种生物胺的标准曲线回归方程、线性范围、检出限和定量限Table 1 Standard curve regression equation,linear range,limit of detection,and limit of quantification of 8 kinds of biogenic amines

由表1可知，8种生物胺的检出限在0.2～0.8 μmol/L之间，定量限在0.7～2.0 μmol/L之间。在分析的8种生物胺中，组胺的检出限最高，而β-苯乙胺的检出限最低。8种生物胺在其定量限浓度～400 μmol/L浓度范围内均显示了良好的线性，相关系数R2均＞0.998 0。在本研究分析的8种生物胺中，任何一种生物胺只要它的一个胺基与衍生试剂发生酰化反应就可获得3个Cl原子，导致生物胺衍生物在电子捕获检测器上具有极低的检出限。

2.3.2 加标回收率试验

按照1.3.4的方法测定各成分的加标回收率，试验结果见表2。

表2 加标回收率试验结果Table 2 Results of standard recovery tests

由表2可知，当生物胺标准物质在葡萄酒样品中的添加浓度为1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L时，8种生物胺的加标回收率范围分别为91.2%～98.2%、94.4%～102.1%和96.6%～101.4%。在任一加标浓度下任意一种生物胺的回收率均在90%～110%范围内，说明方法具有较高的回收率，即方法具有较高的准确度。

2.3.3 精密度试验

按照1.3.4的方法测定各成分的含量并计算精密度试验RSD，结果见表3。

由表3可知，葡萄酒样品的精密度试验结果RSD为1.8%～3.3%。β-苯乙胺的精密度试验结果RSD最低，为1.8%，而酪胺的精密度试验结果RSD最高，为3.3%，每种生物胺的精密度试验结果RSD均＜4%，表明本方法具有较高的精密度。

表3 精密度试验结果Table 3 Results of precision tests

2.3.4 实际样品测定结果

采用本研究建立的方法对2个国内品牌和2个国外品牌的葡萄酒样品生物胺含量进行了检测，其结果见表4。

表4 市售葡萄酒样品中生物胺的含量Table 4 Contents of biogenic amines in commercial wine samples

由表4可知，同一种生物胺含量在不同品牌的葡萄酒中差异较大。从总体上看，腐胺和酪胺的含量较高（84.5～114.2 μmol/L），而亚精胺（0.0～0.9 μmol/L）和精胺（均未检出）的含量较低。对于毒性较强的组胺来说，其在不同品牌的葡萄酒中的含量也存在较大差异（14.3～32.1 μmol/L）。其在国产品牌2中的含量最高，达到了32.1 μmol/L，在国产品牌1中的含量最低，为14.3 μmol/L，前者是后者的2.2倍。此外，在国产品牌2和进口品牌1的葡萄酒中，组胺含量均＞2 mg/L，存在潜在风险。

本研究建立了气相色谱-电子捕获检测法分析葡萄酒样品中8种生物胺的技术，将葡萄酒样品中的生物胺进行提取衍生，采用GC-ECD进行检测，外标法定量。8种生物胺的LOD为0.2～0.8 μmol/L，LOQ为0.7～2.0 μmol/L，平均加标回收率为91.2%～102.1%，精密度试验结果相对标准偏差（RSD）为1.8%～3.3%，该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度。该技术将生物胺提取和衍生合并在一起同步进行，缩短了分析时间，简化了分析步骤，并且由于衍生反应在有机相中进行，因而避免了游离氨基酸进入有机相而被衍生，从而降低了衍生产物色谱峰的复杂性，并且电子捕获检测器对电负性物质具有高选择性，使葡萄酒中生物胺的分析更加简便易行，为含有复杂基质的液态发酵食品中生物胺的分析提供了解决方案。