转基因技术在玉米遗传育种中的应用研究

张 茜，李 新，关雅静

（宁夏农林科学院农业生物技术研究中心，宁夏银川 750002）

玉米传入中国400 多年来飞速发展，种质资源举足轻重。高产、优质和抗病虫的优质基因是提高作物产量的重中之重[1]。在传统的育种工作中，育种范围相对狭窄，操作精准度较低，良莠混杂，无法准确选择，实际的选育周期较长，并且选育效果也不理想。

1.1 基因工程的进展及应用概况

20 世纪80 年代，RELP 标记构建连锁图被首次提出，各种遗传标记技术也取得了迅猛发展，并逐渐运用至动植物遗传领域中。1983 年，世界上第一例转基因植物在美国培育成功，转基因技术研究日新月异，研究水平不断提高，品种培育呈代际特征，对农业科技和生产力的发展具有强大的推动作用，转基因商业化种植渗透程度加深，引领我国的育种行业进入了全新的发展时代。转基因技术的方法众多，主要包括农杆菌介导法、基因枪介导转化法和花粉管通道法等，其中，基因枪法是最常用、最有效的DNA 导入技术[2]。基因工程技术的广泛运用，对玉米品种改良、玉米病虫害抗性等具有积极意义。

1.2 分子标记技术在玉米遗传育种中的运用

玉米是运用分子标记技术最早的作物之一，并且在长时间的发展与实践中取得了不错的运用成果。在20 世纪80—90 年代，玉米分子标记技术的研究主要停留在理论研究阶段，研究成果为后续的实践奠定了理论基础。20 世纪90 年代以后，分子技术在实践中的应用开始增多，研究方向发生改变，以重要基因的定位研究为主。分子辅助标记有着明显的优越性，可追踪分子活动过程，直接以DNA 形式表现，加之受到外界因素影响较小，其发展较为迅速，种类不断增加。目前，我国已开发运用的分子标记技术包括RELP、RAPD、AFLP 和SSR 等种类。

1991 年，世界上第一张玉米RFLP 连锁图谱被成功构建，但其标记相对较少，仅有50 个。在后续的研究中，相关科学家又增加标记了217 个位点，借助B-A易位系，定位在染色体上。较其他标记而言，SSR 标记发展起步较晚，发展时间较短，但其以显著的优势，发展迅速并且运用广泛。1994 年，某科学家利用（DE811×B73）组合，标记了32 个SSR 位点。借助分子标记图谱，育种者能够选择目标性状的基因型，合理选择育种方法，进而提高育种计划的科学性，提高玉米的产量与质量。1994 年，某科学家鉴定3100 个顶交（B73×Mo17）的F4，发现其中有5 个QTL 对籽粒重量有多效性，主要在1、2、5、9 号染色体上，效应最大的基因位于9 号染色体的短臂上。目前，科学家利用RFLP 等技术已经标记了玉米的许多重要性状，如生育期、品质、抗性等，覆盖了整个基因组，为基因工程在玉米遗传育种中的运用提供了可靠保障[3]。

在利用转基因技术的过程中，转基因方法也越来越多。相关人员需结合实际需要，合理选择转基因方法，以达到预期目标。

2.1 农杆菌介导转化方法

农杆菌介导法是研究最深入、使用最广泛的遗传转化方法。目前已经获得的转基因植物中60%以上都是由农杆菌介导法生产的，可运用到玉米转基因操作中的主要有根癌农杆菌、发根农杆菌。其中，Ti 质粒的研究最多，是现在转基因技术中最常用的方法，可成功侵染到玉米中，在植物根部或茎基部伤口处形成冠瘿瘤。农杆菌介导法中，Ti 质粒侵染玉米，T-DNA 从质粒上脱离下来，被插入到该植株的基因中，并且后代不会发生性状分离，能够稳定遗传，但是并不会植入到植株细胞中，形成一个遗传转化系统。

现阶段，农杆菌介导法主要用于双子叶植物和裸子植物的遗传转化[4]。该方法通过使农杆菌载体与植株体分生组织和生殖器官接触来完成遗传转化。接触可以通过真空渗透法、浸蘸法或注射法完成，然后利用组织培养、抗生素筛选和分子检测培养和分离转基因的子代植株。农杆菌介导法的技术特点为技术成熟、操作简单、快速，且成本低，容易掌握，外源基因低拷贝，转化率高，可有效避免基因沉默现象，整合率高，筛选可靠，是目前制备转基因植物成功率最高的方法，在植物遗传转化中运用广泛。

2.2 基因枪介导转化法

基因枪介导转化法是除了农杆菌转化法外使用最广泛的遗传转化技术。基因枪也被称为生物弹道技术，借助压缩气体产生的冲击波，将粘有DNA 的细微金粒高速射入受体细胞或组织中，穿过层层结构，直至到达细胞核。粘有DNA 的微粒在进入细胞后，会被整合到宿主的细胞DNA 上，发生基因突变，完成基因转移的目的[5]。基因枪法最早运用于20 世纪90 年代，该种方法的优势显著，不受物种和轰击部位限制，不需要重复培养原生受体，操作简单快捷，命中率高，转化时间短，无细胞特异性，不依赖基因型，受体材料、靶细胞来源广泛。但是该种方法也存在一定的弊端，如对玉米细胞造成损害、嵌合体多、转化成本高、遗传性不稳定、随机性太强和整合效率低等。

2.3 花粉管通道法

花粉管通道法在我国应用十分广泛。其原理为利用植物天然授粉过程中花粉粒萌发形成的花粉管通道，通过花粉管通道，在自花授粉阶段将外源基因导入囊胚，使植株直接产生遗传转化后的种子。花粉管通道法的技术特点是不需要组织培养诱导，转化后可直接得到种子，对设备要求低，转化率高，可大批量转化，利用植物天然授粉条件，适用作物类型广泛。同时，该种方法操作简单、很容易实施、育种周期短，可以转化任何基因型材料，并直接运用到常规育种中。此外，还有改进的花粉管通道技术，选取自交授粉后的玉米果穗，时间以授粉后18～26 h 为宜，留下2 cm 的花丝，其余剪除，使用酒精消毒处理，沿穗轴将玉米花茎基部的叶子平均切成3 份，剥开，剪去部分花丝，滴加外源DNA溶液，使外源DNA 直接进入幼胚，以降低遗传变异的概率。但是，由于玉米花丝通常较长，且长短不一，操作难度较大，加之授粉时间的限制，导致外源DNA 片段上限受限，外源DNA 随机整合的偶然性大，从而使其应用受限。

转基因技术在我国各行各业中运用均较为广泛，尤其是在农业中发展已经相对较为成熟。玉米是我国第一大粮食作物，有着悠久的种植历史，但其深受病虫害的影响，是千百年来难以解决的“顽疾”。近年来，世界各国的农业公司均纷纷推出了培育的转基因玉米品种，玉米种植面积不断扩大，正逐渐形成商业化种植模式，获得了良好的经济效益和社会效益。以下进行详细阐述。

3.1 抗虫转基因玉米

据统计显示，严重虫害可导致年份减产30%，严重病害导致平均减产10%。我国作为农作物病虫害多发区和重发区，受玉米螟为害显著，造成的玉米损失重大。在种子包衣中喷洒化学杀虫剂，能够预防部分侵蚀幼芽期的害虫，一般不会对种芽造成伤害。但在植株生长过程中喷洒杀虫剂，则会对生态平衡造成影响，破坏生态环境，造成农药污染等问题。在传统的抗螟品种培养方法中，育种周期长，并且实际的育种效果也不佳。因此，科学家们开始探索更加安全、有效和经济的生物防治技术，经过不断尝试，苏云金芽孢杆菌（Bt）表现出优异的抗虫效果。但是该种基因只对鳞翅目害虫具有毒害作用，且在光照作用下容易分解，效果持续时间较短，在实际的田间操作中较为困难，难以作为商品制剂批量生产。

Bt 基因作为一种抗虫基因，能够在玉米包衣和植株的生长过程中代替化学杀虫剂的功效[6]。Bt 芽孢在形成过程中会分泌毒蛋白，以原毒素的形式存在于体孢晶体中。该种原毒素在玉米植株体内一旦被虫体摄取，则会破坏昆虫的肠道环境，在微碱性环境下，产生毒性肽链分子，在虫体肠道表面产生受体，起到有效的抵抗作用，使幼虫停止进食，直到死亡，可使玉米产量平均增加9%。害虫在取食玉米时，则会将该种蛋白摄取进“肚中”，在碱性肠道环境下被活化，进而杀死害虫。而CpTL 基因对玉米螟、鞘翅目玉米根叶虫、杂拟谷盗和直翅目蝗虫等均具有抗性。

传统的玉米除虫措施一般使用化学杀虫剂，但杀虫剂对益虫也有较强的杀伤力，且长期大量使用化学杀虫剂不仅会造成环境污染，加剧生态环境破坏，还会导致农药残留，容易引起人畜中毒。而依靠转基因玉米，则能够弥补传统化学杀虫剂使用的弊端，并且防治效果较好。同时，为了避免或延缓害虫产生抗药性，还需采取相应的防治措施，例如，混种部分普通玉米种子，或继续筛选高抗虫性杂交种。

3.2 抗除草剂玉米

玉米田间杂草对玉米的稳产、高产均具有不利影响，在农业生产中，除草剂的使用越来越普遍，能够节省劳动力、提高劳动效率、保护土壤结构。但是，在使用除草剂的过程中，也会在一定程度上对玉米植株造成伤害，污染生态环境。在玉米植株的生长过程中，将抗除草剂转基因技术运用其中，可保证玉米健康生长，减少除草剂对玉米植株的伤害，降低种植成本，实现无公害除草，提高玉米产量，有助于节省人力、物力。

其中，IMI 作为一种优质的抗除草剂玉米，具有非常强的耐受性，除草剂能够直接喷洒在玉米植株上，对1 年生杂草、宽叶杂草的生长均具有良好的防治效果。

3.3 改良玉米类蛋白转基因玉米

玉米作为一种粮食作物与经济作物，其产量虽然较为可观，但整体品质却不容乐观，玉米蛋白质中赖氨酸含量较低。在转基因技术研究的过程中，通过将外源基因导入普通玉米中，可得到优良性状的玉米。由于玉米中赖氨酸较少，科学家利用农杆菌介导法，将富含赖氨酸的马铃薯蛋白质基因导入玉米内，使玉米产量显著提升[7]。基于此，研究人员开始将更加优良的基因导入玉米植株中，以提高玉米中氨基酸的含量。

4.1 基因工程在玉米遗传育种中存在的问题

通过上述分析可以发现，转基因技术在实际的玉米遗传育种运用中仍存在一定的问题。例如，害虫对Bt作物产生抗性，为了解决该问题，在种植玉米时，选择抗虫性转基因玉米与普通玉米混种，可以有效治理害虫抗性。CpTL 基因在使用中需要具备高效的表达条件，这也给转基因技术的实施带来了较大挑战，研究人员还需进一步加深对不同调控机理的研究。同时，利用植物凝聚素基因实施基因工程的研究发展时间较短，其获得的基因植株安全性有待进一步证实。在环境方面，基因工程对生态环境的影响性研究还需进一步加强，而在转化率方面，也存在基因转化率较低、遗传不稳定的问题。

现阶段，我国的基因组研究已经取得巨大成果，已获得的转基因植株均是在长时间的大量研究基础之上得到的转化体克隆，具有很强的基因型依赖性，再生频率较低。同时，受到历史条件与现有研究水平的限制，我国转基因玉米产业化亟须突破，需引起高度重视，想在短时间内赶超发达国家任重道远。

4.2 基因工程在玉米遗传育种中的发展应用

种植转基因作物可提高社会效益与经济效益、有效控制靶标害虫和作物害虫、保持产量稳定、降低化学农药的喷洒、减少环境污染、降低种植成本、提高农产品质量、提升农产品竞争力。随着转基因玉米工程的进一步发展，我国的转基因玉米种植面积逐年提高，在提高肥料利用效率、防治病虫害、克服土壤逆境、免耕、高效除草和降低劳动力成本等方面均具有重大意义，是解决现代农业重大问题的战略性技术。目前，转基因玉米安全性的争论焦点主要集中在3 个方面。一是国际贸易与对人类的潜在影响；
二是环境伦理和社会伦理与宗教问题；
三是“标签风波”，近年来，转基因食品标签问题在国际上一度引发激烈争论[8]。为此政府部门需加强转基因安全管理，完善相应的技术支撑体系，遴选相关领域的专家，组建安全委员会，展开转基因作物安全评价与安全咨询工作。重视并严格规范生物安全评价工作，相关研究人员需积极承担社会责任、伦理责任，严格遵照相关法规，保证转基因生物试验研究的规范性，公众、科学家与政府需携手共进，维护转基因技术的安全应用，推动其良性发展。

过去，玉米所到之处，都给当地带来了繁荣，现在、未来，亦是如此。玉米作为全球第一大粮食作物，有170 多个国家种植玉米。随着全球化的推进，科研、企业的同场竞技愈发激烈，玉米产业迎来了新的机遇，更面临着全新挑战。生物育种势头正猛，如何创制优质种质资源、研究饲用玉米已成为广大育种工作者需要解决的关键问题。农业生产的发展，良种是关键，借助转基因技术可实现基因重组，提高优良品种的选育效率。在具体实践过程中，相关人员还需在已有研究成果的基础上，结合实际情况，加强新型品种的研究，加深对玉米自交系、杂交系和农家品种的遗传多样性的研究，重点选择关键性状进行基因定位作图，加强种质创新，提高育种效率。在加强转基因技术研究的同时，需密切关注转基因玉米的安全性，评估其对生态环境的影响，使转基因技术走向适用化。