TRPV4,基因相关疾病的遗传学诊断与管理

胡旭昀 郝婵娟

国家儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院 儿科重大疾病研究教育部重点实验室北京市儿科研究所 出生缺陷遗传学研究北京市重点实验室（北京 100045）

瞬时受体电位通道（transient receptor potential channel）是一种位于膜上的阳离子运输通道蛋白，其中瞬时受体电位香草酸家族4通道蛋白（transient receptor potential cation channel,subfamily V,member 4，TRPV4）由于其对Ca2+的高通透性并在多种疾病发展过程中扮演重要角色，而引起学术界的广泛关注[1]。TRPV4基因在全身多种细胞中均有表达。在神经系统方面，TRPV4基因可在外周神经元中表达并参与痛觉敏感[2]。在大脑中，TRPV4基因在神经元和胶质细胞中都有表达，可抑制粘多糖对小胶质细胞的激活，以及调节神经元的兴奋性[3-4]。在骨骼方面，TRPV4不仅可以诱导多能干细胞形成软骨，还可以在成骨和破骨细胞中表达，调节成骨形成和吸收[5-7]。TRPV4基因变异可导致常染色体显性遗传的两组表型显著不同的疾病：神经肌肉病和骨骼发育不良。

1.1 TRPV4基因相关神经肌肉病

TRPV4基因相关神经肌肉病的特征是先天性或迟发性、静止性或进行性的周围神经病变，并伴有喉功能障碍（即声带麻痹）、呼吸功能障碍和关节挛缩的多种组合。

1.1.1 Charcot-Marie-Tooth 病2 C 型 Charcot-Marie-Tooth 病（CMT）是一种周围神经系统异常的疾病，以远端肌肉的进行性虚弱和萎缩为特征，最初是腓骨肌受累，进而发展为手臂。根据电生理和组织病理特性，CMT 分为两大类：原发性外周脱髓鞘神经病（CMT 1）和原发性周围轴突神经病（CMT 2）。Charcot-Marie-Tooth 病2 C 型（CMT 2 C，OMIM#606071）的神经病变特征为轴变异性，无明显髓鞘改变，神经传导速度正常或轻微降低，进行性远端肌肉无力和萎缩，伴膈肌和声带麻痹[8]。发病年龄从出生至60岁不等，发病越早症状越严重。

1.1.2 肩腓型脊髓性肌萎缩 肩腓型脊髓性肌萎缩（scapuloperoneal spinal muscular atrophy，SPSMA，OMIM #181405）的特征是进行性肩胛腓骨萎缩和无力，严重时可表现出先天性肌肉缺失。同时还伴有喉功能障碍（同CMT 2 C 的喉软化症和声带异常）、声带麻痹和短暂发音困难。部分患者会表现出一些骨骼异常，如脊柱侧弯、髋关节发育不良、肢体长度不对称、指弯曲、摇椅足等[9]。

1.1.3 先天性远端脊髓性肌萎缩 先天性远端脊髓性肌萎缩（congenital distal spinal muscular atrophy，CDSMA，OMIM #600175）临床表型多变，典型特征为先天性、非进行性下肢运动神经元丧失，导致下肢远端肌无力和萎缩，并伴有先天性（或早期）髋关节、膝关节和踝关节屈曲挛缩。其他可能的症状还包括下肢腱反射减弱或消失、骨骼异常（双侧马蹄足内翻、脊柱侧弯、脊柱后凸、腰椎前凸等）、运动发育迟缓、蹒跚步态、关节过度松弛和/或膀胱、肠道功能障碍等[10]。

1.2 TRPV4基因相关骨病

根据国际骨骼发育不良学会分类学委员会（Nosology Committee of the International Skeletal Dysplasia Society，NCISDS）发布的第10版命名名录，目前有461种骨病，通过临床症状、影像学表现和/或分子病因将其分为42组[11]。其中TRPV4基因变异导致的一系列骨骼发育不良谱系疾病位于NCISDS分类中第8组，统称为“TRPV4遗传性骨病”。TRPV4遗传性骨病主要以常染色体显性模式致病，该基因变异引发的疾病表型多样，从轻型的短指关节病到严重的致死型变形骨发育不良，由轻到重包括6种骨病亚型[12]。

1.2.1 家族型短指关节病 家族型短指关节病（familial digital arthropathy brachydactyly，FDAB，OMIM #606835）的短指畸形在出生时并不明显，在幼儿时期，中/远端指骨开始相对性缩短，指间关节肿胀伴活动受限。患儿多10 岁前发病，手部症状较脚部症状更为明显。进入儿童期后手脚的其他关节出现疼痛和变形。家族型短指关节病的临床症状与其他TRPV4遗传性骨病相对较为独立，并不表现出不成比例的身材矮小和进行性脊柱畸形。该病应与反应性关节病、糖尿病性关节病和其他形式的短指进行鉴别诊断。

1.2.2 常染色体显性短躯干3 型 常染色体显性短躯干3型（autosomal dominant brachyomia type 3，AD-BO，OMIM #113500）是伴有身材矮小的TRPV4遗传性骨病中表型最轻微的。其名字来源于希腊词根“brachy-”和“-olmos”，分别意为“矮小”和“躯干”。患者只有轻微的身材矮小，四肢及运动功能不受影响。即使在同一家系中不同患者的严重程度也可能不同，身高范围可在正常身高到中度矮小之间。

1.2.3 Kozlowski型脊柱干骺端发育不良 Kozlowski型脊柱干骺端发育不良（spondylometaphyseal dysplasia，Kozlowski type，SMDK，OMIM #184252）以短躯干型矮小为特征，患者出生时身长在正常水平，一般在儿童早期出现生长缓慢、身材不成比例、步态异常和膝内翻等症状并愈发明显，同时常见早发性骨关节炎，成年平均身高130～150 cm。

1.2.4 Maroteaux型脊柱干骺端发育不良 Maroteaux型脊柱干骺端发育不良（spondyloepiphyseal dysplasia，Maroteaux type，SEDM，OMIM #184095）以短躯干型身材矮小和短指畸形为特征。出生时身长在正常水平。儿童期出现明显的生长缓慢和短躯干型身材矮小等症状。随着时间的推移，膝外翻和脊柱侧弯逐渐发展。部分患者有骨质疏松症的表现。其他骨骼症状包括椎管关节发育不良、骨龄延迟、椎体变扁、椎体终板不规则、方形髂骨翼、长骨/股骨干骺端发育不良和腕骨畸形等。

1.2.5 类扭伤型侏儒 类扭伤型侏儒（OMIM #168400）可能是最罕见的TRPV 4遗传性骨病，其特征是严重的肢体畸形、关节错位/挛缩、膝外翻、长骨弯曲、身材矮小和脊柱侧弯，这些症状一般是先天性的，并逐年加重。成年平均身高90～110 cm。该病需要与COL2A1变异导致的Kniest发育不良（主要差别包括椎骨扁、管状骨缩短、干骺端扩张以及胸骨短宽）、COL11A1或COL11A2变异导致的纤维软骨增生症（主要差别包括肢根缩短、干骺端呈哑铃形、椎体呈梨形以及肋骨远端呈杯状）以及HSPG2变异导致的Dyssegmental发育不良。

1.2.6 变形性骨发育不良 变形性骨发育不良（metatropic dysplasia，MD，OMIM #156530）的名称来源于希腊语“metatropos”，意为“有变化/变化的模式”，因出生时和儿童期身体比例的显著逆转而得名：出生时由于长骨干骺端异常，四肢与躯干相比有不成比例地缩短；
而在儿童期，当扁平椎、脊柱侧弯和/或后弯变得更严重时，躯干与四肢相比变得相对较短。脊柱异常还累及颈椎C1/2区域，引起齿状突发育不全和半脱位。影像学表现可能有肋骨、长骨缩短及干骺端增宽或不规则。关节表现在X 线片和体格检查中较为明显。由于胸部极窄伴肺实质发育不全，变形性骨发育不良在产前或围生期可能是致命的。围生期存活的婴儿通常会发展为严重的脊柱侧弯，最终影响肺功能。一些严重的患者还可表现出关节活动度差、关节挛缩和斜颈。该病需要与先天性脊椎管发育不良（COL2A1变异）、Morquio综合征（GALNS或GLB1变异）、X-连锁迟发性脊柱骨骺发育不良（TRAPPC2变异）进行鉴别诊断。

2.1 TRPV4基因与蛋白结构

TRPV 4基因位于12 号染色体q 24.11 区域，包含15 个外显子，编码的通道蛋白由871 个氨基酸组成。功能性TRPV 4 通道在体内以同源四聚体形式存在，每个亚基包含一个N 端锚蛋白重复结构域（ankyrin repeats domain，ARD）、6个螺旋的跨膜区（transmembrane，TM 1-6）、C 端的钙调蛋白结构域（Cam-binding domain，CaMBD）等。

TRPV 4 蛋白的ARD 结构域为TRPV 家族所共有，由6个锚蛋白（ankyrin，ANK）重复序列组成，在蛋白识别和相互作用上起到关键功能[13]。ANK的上游是一个脯氨酸富集区域，该区域可与酪蛋白激酶底物3相互作用并参与囊泡运输、细胞骨架重构等[14]。ARD末端的磷酸肌醇结合位点可以接收机械信号和化学信号，激活TRPV4通道[15]。通道的门控开关由跨膜区的螺旋TM 3 和TM 4 构成，钙离子通过TM 5和TM6以及中间的袢环组成的通道进行流入。在C端，CaMBD与钙调蛋白结合，调控该通道激活的速率和程度。除此之外，C端尾部还包含一些其他重要功能的区域，如瞬时受体电位盒结构域和细胞骨架结合位点等。如果基因变异位点发生在上述不同的结构域，可能导致TRPV4蛋白不同程度的影响，从而引起表型各异的临床症状。

2.2 TRPV4基因变异的遗传学检测

TRPV 4基因相关疾病具有高度的表型异质性，同一疾病临床严重程度差异较大，不同疾病之间的表型又具有高度的重叠，仅依靠临床症状进行确诊较为困难。利用基因诊断技术，对疑似患者进行分子诊断，鉴定致病变异，可有效地对患者的具体疾病进行确诊。

TRPV4基因的遗传学诊断主要是利用不同测序技术对基因序列进行分析。如果临床症状高度提示TRPV4基因相关疾病，可以对该基因进行PCR扩增和一代测序（即Sanger测序）。一代测序可有效地鉴定到TRPV4基因的错义变异、无义变异、剪接位点变异等单核苷酸变异（single nucleotide variant，SNV），以及基因内的小插入/缺失变异。一代测序虽然不能检测外显子层面以及基因层面的重复/缺失，但是值得注意的是，目前TRPV4基因并未报道过这一类的致病变异，所以一代测序仍是检测TRPV4基因相关疾病的有效方法。

随着二代测序的发展，panel 测序、全外显子测序，甚至全基因组测序越来越多的应用于罕见遗传病的基因诊断中[16]。二代测序可同时检测包括TRPV4基因在内的多个可能的致病基因。由于可以较少地依赖临床医师的经验，这一策略对具有高度异质性的疾病的诊断效率有显著提升。例如，根据NCISDS最新的指南，目前已知的437个致病基因共可导致有425 种遗传性骨病[11]，在此基础上设计的panel可以一次性检测所有遗传性骨病致病基因，简化了患者诊断流程，缩短了诊断周期。同时，随着测序成本的降低，更多的临床医师考虑对骨骼发育不良直接进行全外显子测序，不仅进一步扩大了检测范围，还可以利用生物信息学算法检出大片段拷贝数变异[17-18]。而对于全外显子测序后仍为阴性的患者，可考虑全基因组测序、RNA测序等。

2.3 TRPV4基因变异谱

自从2008年在常染色体显性短躯干3型患者上鉴定到第一个TRPV 4基因变异至今，已有超过100个TRPV 4基因变异在不同疾病的患者身上被检出（HGMD professional 2022.3）。目前已报道超过30个变形性骨发育不良的致病变异，是最常见的TRPV4基因相关骨病，其次是Kozlowski 型脊柱干骺端发育不良，报道超过10 个变异。神经肌肉病方面，最常见的疾病是Charcot-Marie-Tooth病2C型，目前也已报道超过30 个变异。从变异类型的角度而言，由于TRPV4基因变异的机制主要是功能获得性改变，TRPV4基因变异谱以错义变异为主，占比90%以上。其次还有少数的框内插入/缺失变异。暂无大片段的TRPV4基因拷贝数变异导致疾病的报道。

此外，虽然目前已知的TRPV 4基因相关疾病均为常染色体显性遗传，但仍有个别TRPV4基因隐性遗传病例的报道，如功能获得性变异p.Ser94Leu的纯合变异可能会导致轴突神经病变、声带麻痹和多发性关节炎的联合表型[19]；
而p.Glu840Lys和p.Asn 833 Ser 的复合杂合变异可能与一对兄妹的小头畸形、肌张力障碍、感音神经性耳聋、视网膜病变、骨骼异常和神经病变有关[20]。

一般而言，一个特定的TRPV4基因变异仅会导致神经肌肉病或骨骼发育不良的其中一种，但是该结论并不绝对[21]。这使得TRPV4基因的基因型-表型关联性分析变得较为困难，基因与临床表型的内在关系并不明确。但是，目前仍有少数的功能研究表明，TRPV4基因功能获得性变异可能与神经肌肉病或严重的骨骼发育不良有关，而功能缺失性变异可能与家族型短指关节病有关[22-23]。但这一结论仍需要进一步的证据证明。

3.1 神经肌肉病基因型-表型关联性

大多数导致神经肌肉疾病的变异位于N端锚蛋白重复结构域（ARD）内的带有高正电荷的蛋白指环上。该区域高度保守，且有27 个在所有不同物种同源基因上都存在的精氨酸残基。这些精氨酸残基的变异往往导致不同的神经肌肉疾病：p.Arg186Gln、p.Arg 232 Ser、p.Arg 237 Leu、p.Arg 269 Cys 等变异是Charcot-Marie-Tooth 病2 C 型的常见致病原因；
p.Arg232Cys、p.Arg315Trp、p.Arg316Cys是肩腓型脊髓性肌萎缩的热点致病变异[9,24-25]。然而这些变异之间仍存在表型异质性，甚至同一变异在不同的家族成员中表型也不尽相同[25]。

3.2 骨病基因型-表型关联性

目前，HGMD已报道TRPV4遗传性骨病相关的明确致病变异已超过50个，大部分变异集中在ARD结构域、跨膜区TM4-TM6以及两侧的位置。在这些变异中，MD的致病变异占绝大多数，并广泛地分布在蛋白的各个位置。但是这些位置中，位于AA795-804的自抑制结构域（auto-inhibitory domain，AID）上的变异是MD的热点变异，尤其是Pro799残基的多种变异（p.Pro799Arg、p.Pro799Leu、p.Pro799Ala、p.Pro 799 Ser 等）均与MD 有关[26-27]。AID 结构域位于CaMBD 上游，通过静电作用使通道保持关闭状态，抑制CaM 结合到CaMBD 结构域。该结构域内的变异不仅使通道基础活性增强，且使通道对Ca2+-CaM的反应减弱，从而导致MD[28]。

家族型短指关节病目前报道的变异较少，但是具有强烈的遗传学特征。该疾病的致病变异仅限于锚蛋白重复结构域的ARD3和ARD4之间的第三指区域（p.Gly270Val、p.Arg271Pro、p.Phe273Leu）[22]。其他TRPV4遗传性骨病的变异则无明显规律。

此外，还有一些特殊的变异，如p.Ala217Ser[29]、p.Arg315Trp[30]、p.Ser542Tyr[31]等，可同时引起神经肌肉病和/或骨骼发育不良相关疾病，即使在同一家族中，症状也可能存在显著差异[31]。

4.1 临床管理

患者鉴定到TRPV4基因致病变异后应及时的补充相关的临床评估。除了利用肌电图和影像学检查评估神经肌肉系统和骨骼系统的受累程度，还需要进一步评估声带状态、听力情况和呼吸功能等。目前对TRPV4基因变异患者的治疗多为支持性治疗，以显著改善患者的生存质量。对于已经出现的症状可以进行手术等方法进行干预，如对严重脊柱发育异常患者进行矫形外科手术，对声带麻痹进行杓状软骨切除术和气管切开术等。其他支持性治疗手段包括踝-足矫正器、人工耳蜗等。对于暂未出现的临床表现也需要每年进行监测。患者应定期筛查可能加重神经病变的疾病，如糖尿病、维生素缺乏等。同时应避免肥胖（加重行走困难）、使用神经毒性药物（如氟喹诺酮类、反应停等）以及从事对脊柱和负重关节造成过度压力的活动和职业。

4.2 遗传咨询

由于TRPV4相关疾病最严重时可导致患者早期夭折（如致死型MD），所以这一类患者携带的变异一般为新生变异。而症状较轻的TRPV4相关疾病则有可能遗传自双亲之一。患者父母可能表现为无症状，或具有与先证者严重程度不同的临床表现。这首先是由于TRPV4相关的神经肌肉病具有外显不全的特点；
其次TRPV4相关的骨骼发育不良虽然外显率较高，但是在不同家系或同一家系不同成员中表型异质性显著[26]。因此，对于TRPV4相关疾病患者强烈建议对其父母进行验证，以发现父母身上可能存在的漏诊情况，并提供可靠的复发风险咨询。如果父母样本未发现携带致病变异，则需要注意亲缘关系验证和生殖系嵌合等因素。由于存在父母生殖系嵌合的可能性，患者同胞的发病风险或父母再生育的复发风险约为1%[32]。TRPV4相关疾病患者后代理论的再发风险是50%。然而，由于外显率不全和表型异质性，遗传到变异的后代的临床表型、发病年龄和疾病严重程度无法准确预测。

此外，还可以针对先证者身上鉴定到的TRPV4致病变异进行产前和植入前基因检测。然而具体症状、发病年龄和疾病严重程度不能根据产前检测结果进行可靠预测。所以在是否使用产前检测和如何面对检测结果方面，需要医疗人员和患者进行充分沟通并尊重个人意愿。

医学遗传学的发展带动了罕见遗传病分子诊断的进步。TRPV4基因变异导致的疾病症状各异，因此在这些疾病的分子病因明确之前，被临床归类为多个相互独立的疾病。自2008年第一个TRPV4基因变异被鉴定至今，这些相互独立的疾病由于存在高度相似的分子致病机制，被归为一个大类：TRPV4相关疾病[11]。对患者进行遗传诊断明确分子病因具有重要意义。一方面可以为患者提供适合的干预手段和监测指导，另一方面也可为患者家庭提供遗传咨询。这需要骨科、神经内科、耳鼻喉科、新生儿科、康复科、营养科、儿童保健科及医学遗传科等多学科的共同努力。此外，由于TRPV4蛋白的结构域功能复杂，参与多种生理生化活动，许多疾病的具体致病机制仍未完全阐明，需要我们进一步利用细胞及动物实验，深入研究相关发病机制，提供新的临床诊断思路和治疗方法。