延迟取卵补救措施对空卵泡综合征患者体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响

潘丹，杨杰，文雯，王磊，王瑞，孟彬，于玲，师娟子，周寒鹰

(西北妇女儿童医院，西安 710004)

空卵泡综合征是一种在体外受精/卵胞浆内单精子注射(IVF/ICSI)过程中没有成熟卵母细胞被取出的现象。在自然周期及IVF/ICSI促排卵周期均可能发生[1]，其发生率为0.6%～3.5%[2-3]。虽然发生率很低，但目前仍是临床上面临的棘手问题。2008年，Stevenson等[4]首次将这一现象具体分型，提出真性空卵泡综合征与假性空卵泡综合征的概念。假性空卵泡综合征通常被认为是由外界因素如人为或药物使用不当所造成的取卵日β-HCG较低(<40 U/L)，不能取到卵母细胞。目前已有多篇文献报道可以再次补救注射HCG药物后继续取卵[5-6]。当取卵日血清β-HCG≥40 U/L而未获卵者被定义为真性空卵泡综合征。

真性空卵泡综合征病因机制比较复杂且预后不佳。尽管目前大多数研究认为在IVF/ICSI周期中，空卵泡综合征无法被提前预知[7]。即使前次IVF/ICSI周期发生空卵泡综合征，并不能代表再次取卵会出现相同情况[4]。亦有研究认为，对于空卵泡综合征患者，再次IVF/ICSI助孕时通过双扳机可以改善获卵率，达到较好的妊娠结局[3,8]。但是，在HCG扳机药物及时机正确的前提下，当取卵时穿刺数枚卵泡持续未获卵时，该如何采取补救措施，目前国内外并没有统一的定论。因此，本研究回顾性分析了我中心IVF/ICSI周期中取卵日获卵差的患者，探索延迟取卵是否可以改善患者的预后。

一、研究对象及分组

回顾性分析从西北妇女儿童医院生殖医学中心数据库导出的2019年1月至2021年12月期间在我院行IVF/ICSI-ET助孕患者的临床资料。研究对象纳入标准：(1)IVF/ICSI治疗周期取卵日预计获卵数≥5枚；
(2)取卵日穿刺至少3枚≥17 mm卵泡且反复冲洗未获卵者；
(3)延迟取卵患者取卵当日β-HCG≥40 U/L。

按照纳入标准，本研究共纳入取卵时获卵差的患者72例(72个IVF/ICSI周期)。当穿刺3枚卵泡未获卵时，根据是否选择延迟取卵将患者分为正常取卵组(不暂停取卵手术，继续完成全部目标卵泡穿刺)45个周期和延迟取卵组(暂停取卵手术，测血清β-HCG≥40 U/L时，延迟3～4 h再次穿刺剩余目标卵泡)27个周期。比较两组患者的一般资料、促排卵及胚胎情况、鲜胚及冻胚移植妊娠结局。本研究通过我院生殖医学伦理委员会审核(医伦会审[2022]第007号)。

二、研究方法

1.促排卵方案及黄体支持：所有患者在促排卵8～14 d后当至少2个卵泡直径≥18 mm或3个卵泡直径≥17 mm时，予皮下注射重组人绒毛膜促性腺激素(艾泽，默克雪兰诺，英国)250 μg或注射用绒促性素(HCG，珠海丽珠制药)5 000～10 000 U扳机。扳机后36 h在阴道超声引导下穿刺采卵。拟新鲜周期移植的患者，于取卵日开始黄体支持，根据患者年龄、病史和本周期胚胎发育情况，移植1～2个第3天(D3)或D5胚胎。胚胎移植后14 d血β-HCG>7 U/L为HCG阳性，胚胎移植后4～5周B超检查宫腔内见孕囊及胎心搏动者为临床妊娠，妊娠28周及以上娩出存活胎儿者为活产。移植完本次取卵周期所有胚胎后的活产定义为累积活产。

2.空卵泡综合征补救措施：取卵日穿刺至少3枚≥17 mm卵泡且反复冲洗未获卵者，充分告知患者取卵情况及后续可以选择的补救治疗方案：继续正常取卵或暂停手术后检测β-HCG水平确定下一步取卵时间。由于空卵泡综合征目前并无统一且有效的补救措施，而延迟取卵存在提前排卵的风险且再次手术医疗费用会增加，故应充分告知患者具体情况，建议患者根据自身实际来选择。

3.主要参数及标准：延迟取卵组患者同一日经历了两次取卵手术，计为1个取卵周期；
受精失败率=受精失败周期数/总受精周期数×100%；
无可利用胚胎率=无可利用胚胎周期数/总受精周期数×100%；
提前排卵率=提前排卵周期数/总促排周期数×100%；
活产率=活产周期数/移植周期数×100%；
累积活产率=累积活产周期数/总取卵周期数×100%[9]。按照Peter卵裂期胚胎评分系统评估D3胚胎质量，Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级胚胎视为可用胚胎，Ⅰ级和Ⅱ级胚胎视为优质胚胎。D5可利用囊胚为≥3期，内细胞团和滋养层细胞评级至少包含一个“B”及以上；
D6可利用囊胚为≥4期，内细胞团和滋养层细胞评级至少包含一个“B”及以上。

三、统计学方法

一、两组间一般资料、促排卵及胚胎情况比较

延迟取卵组患者的体质量指数(BMI)和多囊卵巢综合征(PCOS)占比显著低于正常取卵组(P<0.05)；
两组间平均年龄、不孕年限、基础窦卵泡数(AFC)、子宫内膜异位症(EMs)占比等比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组间一般资料比较[(-±s)，n(%)]

延迟取卵组患者的实际获卵数、MⅡ卵数(ICSI周期)显著高于正常取卵组(P<0.05)；
两组间Gn用量及用药天数、HCG日E2及孕酮(P)水平、预计获卵数、提前排卵率、受精失败率、可用胚胎数、无可用胚胎率及优质胚胎数等均无统计学意义(P均>0.05)(表2)。

表2 两组间促排卵及胚胎情况比较[(-±s)，M(P25，P75)，n(%)]

二、两组间妊娠结局比较

正常取卵组共22个周期进行鲜胚移植，延迟取卵组共11个周期行鲜胚移植；
两组患者鲜胚移植周期的单胚胎移植比例、移植囊胚比例、移植优胚比例及活产率等均无显著性差异(P>0.05)(表3)。正常取卵组和延迟取卵组均有9个冻融胚胎移植(FET)周期；
两组患者FET周期的单胚胎移植比例、移植囊胚比例、移植优胚比例及活产率等均无显著性差异(P>0.05)(表4)。两组患者的累积活产率比较，延迟取卵组的累积活产率略高于正常取卵组，但尚无显著性差异(P>0.05)(表5)。

表3 两组患者鲜胚移植周期妊娠结局比较(%)

表4 两组患者FET周期妊娠结局比较(%)

表5 两组患者的累积活产率比较(%)

三、累积活产率影响因素的Logistic回归分析

在校正了年龄、BMI、AFC、不孕年限、Gn启动量、Gn用量及天数、是否延迟取卵等混杂因素后，实际获卵数越多累积活产率越高，二者呈显著正相关(P<0.05)(表6)。

表6 累积活产率影响因素的Logistic回归分析

空卵泡综合征的发生率虽然很低，但是这部分患者往往结局较差，给患者及家庭带来极大的经济负担及精神压力[10]。目前关于空卵泡综合征的发病机制仍未明确，且这类人群无法在IVF/ICSI取卵之前被预测性地识别[4]。这可能和发生率太低，无法进行大样本的对照研究有关系。目前认为空卵泡综合征可能的发病因素有：(1)与基因变异及遗传有关[11-12]，如黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(LHCGR)、透明带(ZP)等基因突变后，外源性重复给予HCG并不能改善妊娠结局[13-14]；
(2)与卵巢储备功能下降及卵母细胞老化有关[1，15]；
(3)由于颗粒细胞凋亡机制受损，导致卵母细胞功能障碍[16]；
(4)与HCG生物活性的内在缺陷和功能失调相关。早在1997年就有学者报道，足够的HCG暴露时间可以促使卵母细胞-卵丘复合体与卵泡壁分离，从而成功获卵[17]。亦有研究认为注射HCG后36 h未获卵可能和卵子成熟延迟有关，而不应该被盲目诊断为空卵泡综合征[18]。对于IVF/ICSI周期中，正常HCG注射后36 h首次取卵穿刺数枚卵泡未获卵者，延迟6 h后再次取卵，其中70%的患者可以获得理想数量的卵子；
但是该研究只随访到了获卵数，没有涉及在等待过程中是否提前排卵及活产率等结局[19]。有研究证实，补救性的增加HCG注射，或者前次IVF周期无获卵人群再次IVF周期中延迟至注射HCG后40 h取卵，患者的成熟卵子数、2PN数、可用胚胎数均有提高，首次FET活产率达到44.44%[20-21]。但其中一项研究仅包含13例患者，且为自身前后对照研究[20]，故研究结论存在一定局限性。另有研究认为，对前次IVF无获卵者，通过HCG和促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)双扳机，亦可以促进卵母细胞成熟，从而获得成熟卵子，但是目前这种方法仅为个案报道[22-23]。

本研究纳入72例空卵泡综合征患者，分析延迟3～4 h取卵是否改善获卵数及妊娠结局。研究结果显示，与正常取卵组相比，延迟取卵组的实际获卵数、MⅡ卵数均显著增高。虽然相较于延迟取卵组，正常取卵组患者存在BMI高、合并PCOS比例高等可能导致空卵泡的高危因素[24-25]，但通过回归分析校正这些混杂因素后，仍提示伴随实际获卵数的增加，累积活产率亦更高，因此认为通过延迟取卵的策略，可以增加实际获卵数，从而提高累积活产率。这可能是因为HCG充分作用于颗粒细胞后再取卵，促进了卵母细胞减数分裂，卵丘细胞完全扩张并从卵泡壁上分离[22]，从而增加实际获卵数及提高累积活产率。

PCOS患者进行IVF/ICSI助孕时，延迟取卵可以获得较好的妊娠结局。有研究认为PCOS患者在HCG注射后38 h取卵，可以提高卵泡中VEGF的表达，促进卵母细胞成熟，提高卵母细胞的质量、受精能力及胚胎发育潜力，从而获得更多的优质胚胎[26]。若PCOS患者需采取卵母细胞体外成熟(IVM)时，在HCG作用后38 h取卵，卵母细胞成熟率更高[27]。对于PCOS患者，延长HCG暴露时间至37～38 h，可促使卵母细胞复合物与卵泡壁充分分离，增加获卵数，且能促进卵母细胞成熟、核质同步化，从而改善卵子及胚胎质量，最终改善新鲜周期的临床妊娠率[28]。本研究中正常取卵组PCOS患者多，实际获卵数及MⅡ卵数均比延迟取卵组少，这可能和取卵时机不恰当有关。由于样本量较少，接下来需要继续扩大样本量进一步研究。

延迟取卵本身并未影响子宫内膜的容受性。Franasiak等[29]认为新鲜周期移植D6囊胚后妊娠率下降可能与子宫内膜-胚胎发育不同步有关。而本研究中，两组患者鲜胚移植周期活产率相似，其原因可能是虽然延迟取卵组患者获卵、授精、胚胎发育均落后3～4 h，但其鲜胚移植时间并未推后，故子宫内膜与胚胎的同步性并未受到影响。

促排卵方案本身与空卵泡的发生尚无确切定论。Singh等[24]分析了1 968例IVF助孕患者，认为拮抗剂方案空卵泡的发生率达6.67%，高于激动剂等其他促排卵方案(0.67%～2.04%)。然而，Blazquez等[30]分析了12 483例供卵周期患者，发现与正常获卵组相比，空卵泡患者中拮抗剂方案占比高达93.2%，但两组促排卵方案比较并无统计学差异(P>0.05)。本研究中，两组患者拮抗剂方案的占比均高(51.85% vs. 66.67%)，差异亦无统计学意义(P>0.05)。

综上所述，IVF/ICSI患者助孕取卵过程中穿刺数枚直径>17 mm卵泡无获卵时，可考虑延迟3～4 h后再次取卵，可以获得更多的卵子，继而增加累积活产率。虽然本研究将累积活产率作为检验延迟取卵方案效果的结局指标，可信性更高，结论更可靠，但本研究作为回顾性分析，仍存在选择偏倚、混杂因素较多、治疗过程中的异质性等问题，加上此类患者数目较少且不好提前识别，因此，未来需要更多的高质量研究进一步探讨验证。