抑制黄曲霉乳酸菌的筛选与鉴定

巩海强， 柴继宽*， 陈三冬, 尹国丽， 邓秀霞

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续研究中心， 甘肃 兰州 730070)

黄曲霉(Aspergillusflavus)是饲料作物中普遍存在的一种腐生型好氧霉菌[1]。在适宜的条件下，这种霉菌可以侵染生长过程中和收获后的农作物，尤其对花生(ArachishypogaeaL.)、玉米、棉花(GossypiumsppL.)等油料作物的种子危害最为严重，且在侵染过程中会产生黄曲霉毒素[2]。据研究调查发现，与2017和2018年的数据对比，2019年上半年黄曲霉在饲料上污染率有上升趋势，存在较高的安全隐患[3]。同其他谷物比较，玉米胚部占比较大，具有极强的吸湿性，极易受黄曲霉侵染，在黑龙江、内蒙古等9省(自治区)28个县的主要生产基地采集的251份样品(90份全株玉米样品和161份青贮玉米样品)中均检测出黄曲霉毒素[3]，黄曲霉毒素含量超标率高达5.18%[4]。全球超过1.33亿头奶牛每年消耗青贮饲料高达6.65亿吨，其中全株玉米青贮占比超过40%[5]，全株玉米具有丰富的可溶性碳水化合物和较低的缓冲能值，是选用全株玉米青贮的重要原因[6]。但全株青贮玉米饲料有氧暴露后霉菌快速繁殖容易造成有氧腐败从而导致霉菌和霉菌毒素污染等饲料安全问题[7]。被黄曲霉污染的青贮玉米营养品质下降且不易保存，发霉饲料不能利用给生产带来巨大的经济损失，另外富含黄曲霉毒素的饲料会直接危害家畜健康，使家畜中毒甚至诱发癌变。由此可见，解决玉米青贮中黄曲霉污染问题具有深远意义。

目前，防治黄曲霉及其毒素污染主要采用化学方法[8]，但化学添加剂对人体健康的危害性极大，且长期使用会产生抗性[9]，利用天然植物和微生物从源头上控制黄曲霉在饲料中的生长和产毒具有绿色高效、无毒副作用、无残留等优点。然而，开发天然植物成本较高且作用稳定性差，制约了其在生产实践中的应用，而乳酸菌作为一种添加剂在玉米青贮中的利用，备受国内外学者的关注[10-11]，是国际公认的最传统最安全的添加剂之一[12-13]。现有研究发现[14]部分乳酸菌对黄曲霉及其毒素具有拮抗作用，如从泰国发酵面粉中分离出的植物乳杆菌K35(L.plantarumK35)几乎可以完全抑制黄曲霉的生长；
另外李利红等[15]也从大量材料中筛选出2株对曲霉生长有明显抑制作用的乳酸菌，其中1株为发酵乳杆菌(Lactiplantibacillusfermentum)，另1株是植物乳杆菌。但是，目前还少有专用于玉米青贮饲料的抑黄曲霉乳酸菌添加剂。

研究表明，植物表面附着的和内源性的乳酸菌能较好的适应植物生存环境[16]，因此，从植物原料发酵过程中筛选青贮用拮抗乳酸菌是一种高效、快捷的方法。鉴于此，本研究拟从玉米青贮饲料中筛选能有效抑制黄曲霉生长的乳酸菌，以期为解决青贮饲料中黄曲霉及其毒素的污染问题提供微生物资源，并为改善玉米青贮饲料品质和质量安全提供参考。

1.1 样品与菌种

样品处理：于2021年10月11日在甘肃省兰州市西固区采集‘和盛5288’品种玉米，全株蜡熟期收割，切碎(2～3 cm)，压实，用真空包装机袋装密封，制作铝箔青贮袋(25 cm× 16 cm)50个，每袋约重500 g，室内常温条件下，自然发酵30 天。

菌种来源：乳酸菌分离于‘和盛5288’全株青贮玉米发酵第3天，4天，5天，6天，7天，10 天，15 天，25 天，30 天；
黄曲霉标准菌(AspergillusflavusLWCC2009)购自上海鲁微科技有限公司，保存于—20℃冰箱。

1.2 乳酸菌的分离纯化

在全株玉米青贮的第3天，4天，5天，6天，7天，10天，15天，25天，30天打开3包青贮袋。从每包青贮袋中称取适量饲料样品共10 g于250 mL锥形瓶中，再加90 mL无菌蛋白胨水溶液于250 mL锥形瓶中，封口；
后置于摇床以150 r·min-1振荡90 min，取上清液1 mL加入到含9 mL无菌蛋白胨水溶液中适当振荡，将溶液依次稀释成10-5，10-6，10-7三个梯度，各取菌液100 μL在MRS培养基上涂布，每个梯度4个重复，30℃培养72 h；
根据菌落颜色、大小、光泽、有无透明圈等挑单菌落进行划线[12]，不断纯化培养直到获得纯菌株，后将菌株富集后与40%甘油混合置于—80℃冰箱内保存备用[17]。

1.3 霉菌孢子悬液的制备

28℃恒温培养3 d，取孢子制菌悬液[18]，浓度调整为106个·mL-1，待用。

1.4 抑制黄曲霉活性乳酸菌的筛选

采用双层平板法[19]筛选对黄曲霉具有抑菌能力的乳酸菌。用游标卡尺测菌株的抑菌圈直径，计算抑菌率，抑菌率等于抑菌圈直径除以对照组直径。

1.5 菌株的形态特征及生理生化鉴定

观察乳酸菌的菌落形态，并挑取单菌进行革兰氏染色，用油镜观察细胞形状、大小、染色结果及菌体是否有鞭毛和芽孢等。将筛选出抑制黄曲霉能力较强的产酸菌进行基本生理生化特征检测[20]。

1.6 菌株生长速率和产酸速率的测定

将菌株活化2次后，以2%接种量在培养基中培养24 h,温度控制在35℃左右，以未加菌悬液的空白培养基为对照，每2 h取一次样，每株取3个平行样，测定各样品在波长600 nm时的OD值。同时测定发酵液pH值[21]。生长速率是指单位时间内OD值的变化，在图中斜率表示生长速率。产酸速率用单位时间内pH值的变化表示。

1.7 16S rDNA序列同源性分析

将活化的菌株富集培养24 h后离心收集菌体，提取细菌DNA[22]，用细菌16S rDNA的通用引物27F，1492R，进行PCR扩增[23]。反应体系：2×PCR Master Mix，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，9.5 μL ddH2O，总体积为25 μL。反应条件：94℃预变性5 min；
94℃变性30 s，51℃退火45 s、72℃延伸1 min，30个循环；
72℃延伸10 min后4℃保存[24]。检测目的条带后将扩增产物送至擎科生物有限公司测序。

将获得的乳酸菌菌株基因序列信息与NCBI网站里的Gene Bank数据库进行比对，选择与所测序列同源性最高的已知分类地位的菌种。从Gene Bank数据库中下载已知菌株的16S rDNA基因序列，与所测菌株的16S rDNA序列一起，采用Clustal进行比对，用MEGA7.0软件绘制系统发育树(Phylogeny)，确定各菌株分类地位[25]。

1.8 数据分析

采用Excel 2019对数据进行初步整理，采用SPSS 21.0软件对不同菌株测定指标进行单因子ANOVA模型分析，结合Duncan法进行多重比较(P<0.05)。

2.1 乳酸菌的分离培养

通过分离培养共筛选得到50株乳酸菌。在全株玉米青贮第3天、4天、5天、6天、7天、10 天、15 天、25 天、30 天样品中分别筛选出15，7，2，7，10，6，1，1，1株乳酸菌。

表1 菌株编号和菌种来源Table 1 The strains of lactic acid bacteria and their source

2.2 抑黄曲霉活性菌株的筛选

通过抑菌试验发现50株乳酸菌中有7株菌对黄曲霉有明显抑制作用，与其余43株菌株的抑菌直径差异显著(P<0.05)，抑菌圈直径达3.67～4.17 cm，抑菌率在40%以上(表2)。其中抑菌效果最好的是分离自青贮第7天的菌株Q39和Q40，抑菌圈直径都达4.00 cm以上(图1)，抑菌率分别达49.40%和49.60%。50株菌株中有8株菌株完全没有抑菌能力，抑菌率为0%，有35株乳酸菌抑菌直径在2.07～3.15 cm，抑菌率在24.60%～37.50%。

图1 双层平板对峙试验结果Fig.1 The results of double plate confrontation test

表2 乳酸菌对黄曲霉的抑制效果Table 2 Inhibitory effects of the strains of lactic acid bacteria on Aspergillus flavus

2.3 抑黄曲霉菌株形态特征和生理生化特性

7株抑菌菌株革兰氏染色后均呈现紫色，形态为杆状(表3)，均能在5℃，15℃，35℃和45℃生长；
菌株Q13，Q28，Q39和Q40能在pH值3.0～7.0范围内正常生长，因此，可以认为这4株菌株耐酸性较强；
Q49在pH值为3时不生长，另外2株菌株Q11和Q44表现为弱生长(表4)。由表5可知，菌株Q28，Q40，Q44和Q11与22种碳源作用均呈阳性，菌株Q49和Q39与鼠李糖作用呈阴性，与松三糖反应呈弱阳性。菌株Q13利用碳水化合物的能力较弱，与松三糖、海藻糖、纤维二糖、甘露醇作用均为阴性。

表3 抑菌乳酸菌的形态特征Table 3 Morphological characteristics of the strains of bacteriostatic lactic acid bacteria

表4 抑菌乳酸菌的生理生化特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of the strains of bacteriostatic lactic acid bacteria

表5 抑菌乳酸菌碳源发酵试验Table 5 Carbon source test on the strains of antibacterial lactiplantibacillus fermentation

2.4 抑黄曲霉菌株的生长特性及产酸速率

7株菌株的生长速率曲线如图2 a所示，在0～2 h时菌株Q40生长速率最高，Q44生长速率最低，但7株菌均进入对数生长期，在2～4 h时菌株Q11，Q28，Q39和Q40生长速度达到最快，而菌株Q44和Q49在4～6 h生长速度才达到最快，培养4 h时7株菌株间生长速率差异极显著(P<0.01)，Q11和Q49发酵初期生长速率明显低于其他5株菌株，6 h后菌株Q39的OD值为7株菌株最高，12 h后7菌株OD值变化都趋近0(表6)。

7株菌株产酸速率曲线如图2 b所示，0～8 h菌株Q39的产酸速率最高，4～6 h时菌株Q11，Q13，Q39，Q40和Q49产酸速率达到最大值，其中Q39，Q40和Q49显著低于另外4株菌株(P<0.01)，6～8 h菌株Q28和Q44产酸速率达到最大值，8 h后除菌株Q44其余菌株产酸速率逐渐下降，菌株Q44在12 h后开始下降(表7)。在培养12 h后菌液pH值均降低至4以下，产酸速率较快。

表6 抑菌乳酸菌的生长速率Table 6 Growth rate of the strains of bacteriostatic lactic acid bacteria

表7 抑菌乳酸菌的产酸速率Table 7 Acid production rate of strains of bacteriostatic lactic acid bacteria

图2 乳酸菌菌株的生长和产酸速率曲线Fig.2 Growth and acid production rate of the strains of lactic acid bacteria

2.5 抑黄曲霉菌株16S rDNA序列同源性分析

经16S rDNA序列比对及同源性分析发现，Q49，Q39，Q28，Q40，Q44，Q11，Q13与植物乳杆菌(L.plantarum)JCM1149遗传距离最近，其次是戊糖乳杆菌(L.pentosus)124-2(图3)。

目前黄曲霉污染仍是全球玉米作物在饲料及其深加工领域应用的主要问题之一，利用微生物发酵降低毒素污染既经济又高效[26]。研究表明，各种真菌、细菌、放线菌等均有抑制黄曲霉生长的作用，但乳酸菌作为添加剂用于饲料防霉和提高青贮品质的应用更广泛，并具有不破坏营养成分、环保等特点[27]，是用于制作微生物菌剂的首选。本试验从玉米青贮饲料发酵不同阶段中筛选出7株能抑制黄曲霉生长的拮抗乳酸菌，抑菌直径显著高于其他菌株(P<0.05)，抑菌率由大到小依次为Q40(49.60%)，Q39(49.40%)，Q11(44.76%)，Q28(44.44%)，Q49(43.85%)，Q44(43.85%)，Q13(43.65%)，其在抑制黄曲霉生长方面具有很大的应用潜力，这与马妙莲[28]的研究结果相似。

图3 抑菌乳酸菌的 16S rDNA的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of bacteriostatic lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequence

菌株Q49，Q39，Q28，Q40，Q44，Q11，Q13经16S rDNA序列比对及同源性分析发现，与植物乳杆菌JCM1149和戊糖乳杆菌124-2遗传距离最近。目前，普遍认为在种分类水平上如果2个分类单位间同源性高于97.5%，则属同一个种[29]。菌株Q39，Q49，Q39，Q40，Q44，Q11和Q13与植物乳杆菌和戊糖乳杆菌进化亲缘度都近似100%，但具体为哪一种尚不能确定，这与蔺豆豆等[24]关于燕麦附着耐低温乳酸菌的筛选中3株菌的鉴定结果基本一致。植物乳杆菌和戊糖乳杆菌在16S rDNA序列上仅有2 bp的差异，因此16S rDNA鉴定难以区分[30]。因此结合碳源发酵结果进行区分，结果发现菌株Q29，Q40，Q44，Q11和Q13均能发酵D-木糖和鼠李糖，由此可知，这5株菌株为戊糖乳杆菌，而菌株Q49和Q39都不能发酵鼠李糖，且可发酵D-木糖但呈弱阳性，故将这2株菌鉴定为植物乳杆菌[31]。严萍等[32]在饲料玉米中分离出12株优质乳酸菌其中4株为植物乳杆菌，这与本试验中获得的优势菌株植物乳杆菌相一致，除此之外，我们还获得了植物乳杆菌的近缘种戊糖乳杆菌菌株。

目前关于植物乳杆菌作为青贮添加剂的报道较多[33-34],而戊糖乳杆菌作为饲料添加剂用于生产实践较少，但戊糖乳杆菌也是饲料中的常见种，其生理生化特性与植物乳杆菌类似，有大量研究表明植物乳杆菌和戊糖乳杆菌都具有较好的抑菌活性，如章昱等[35]筛选的植物乳杆菌CMCC-P0002，陆春波等[36]关于植物乳杆菌DY6的抑菌机制研究都充分说明植物乳杆菌具有较强抑菌能力。薄礼娟[37]在对戊糖乳杆菌S1-4的研究中证实其在饲料应用中有很好的抑菌效果。杜贺超等[38]研究获得1株抑菌效果最佳的植物乳杆菌PC4-5，能够很好的抑制有害细菌。王昌禄等[39]的研究发现植物乳杆菌可作为益生菌被广泛用于控制黄曲霉的生长。同时郭艳萍等[40]研究筛选获得的6株对黄曲霉有明显抑制作用株菌中3株是植物乳杆菌。王昌禄和郭艳萍与本试验结果相一致，进一步说明植物乳杆菌的确有较强的抑黄曲霉效果。但本试验仅对分离菌株进行抑黄曲霉筛选和初步鉴定，7株菌株间抑菌效果差异显著(P<0.05)。菌株Q13，Q28，Q39和Q40有良好的耐低温和耐低pH能力，在16小时Q39和Q40的pH值分别降低到3.61和3.59，相比杨泽敏等[41]筛选的鲤鱼源植物乳杆菌更低；
菌株Q28，Q40，Q44，Q11和Q39对碳源利用相比于另外两株更好，与尹雪等[12]筛选的3株抑黄曲霉乳酸菌相比可发酵碳源种类更多；
菌株Q44和Q11在培养初期生长缓慢，生长速度显著低于另外5株(P<0.01)，同时在发酵4～24 h菌株pH值均显著低于另外5株菌株(P<0.01)。综上，作为全株玉米青贮发酵的备选添加菌株Q39和Q40有更好的应用前景，但关于菌株的功能特性和抑菌机制尚不明确，仍需进一步研究。

从玉米青贮饲料中初步分离到50株乳酸菌资源，利用双层平板法对菌株抑黄曲霉能力初筛，并结合碳源利用情况、生长及产酸速率最终得到2株有明显抑制效果的菌株，Q39和Q40，其抑菌圈直径为4.15 cm和4.17 cm，为革兰氏阳性同型发酵乳酸菌；
经16S rDNA序列同源性分析并结合生理生化试验确定Q39和Q49为植物乳杆菌，Q11，Q13，Q28，Q40和Q44为戊糖乳杆菌，菌株Q39和Q40可作为全株玉米青贮发酵的备选添加菌株。