自身免疫性肝炎患者外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细胞变化及其临床意义探讨*

王浩宇，周娟燕，刘 茹，徐 菁，马少君

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一种由异常的自身免疫反应介导的肝实质炎症性病变，以血清自身抗体阳性、高免疫球蛋白G(IgG)或γ-球蛋白血症以及肝组织学上存在界面性肝炎为临床特点[1]。最近的研究发现，免疫介导的肝损伤是由自身反应性CD4+T细胞，尤其是辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)诱导的[2]。当机体免疫功能出现异常时，CD4+T淋巴细胞分泌的Th17与调节性T细胞(regulatory cell，Treg)亚群比例失衡，继而引起AIH的发生[3]。自然杀伤细胞(NK)对肝脏免疫功能具有重要的调节作用。近年来，自然杀伤细胞毒性受体NKp46成为免疫学领域研究的热点之一[4]。学者认为，3型天然淋巴样细胞(type 3 innate lymphoid cell，ILC3)与肝脏炎症性疾病有关[5]。本研究通过分析AIH患者外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细胞百分比的变化，以探讨它们的临床意义。

1.1 病例来源 2016年2月～2020年2月我院收治的AIH患者43例，男性6例，女性37例；
年龄为32～60岁，平均年龄为(45.2±7.2岁)。符合《自身免疫性肝炎诊断和治疗共识(2015年)》[6]的诊断标准，体质指数(body mass index，BMI)为19.7～27.1 kg/m2，平均为(22.9±2.2)kg/m2。符合以下任意一项者，诊断为重度AIH：(1)血清总胆红素>85μmol/L；
(2)发生肝性脑病；
(3)影像学检查显示肝实质呈异质性改变或肝萎缩。排除标准：(1)合并肝硬化；
(2)嗜肝病毒，包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染；
(3)既往有肝脏手术史；
(4)严重的心脑血管疾病；
(5)恶性肿瘤。所有患者签署知情同意书，本研究已取得我院医学伦理委员会审批通过。

1.2 外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细胞百分比检测 采集外周静脉血3 ml，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，加入肝素抗凝，并加入相同体积的Hank’s液(北京索莱宝科技有限公司)，充分混匀，4℃下1500 r/m离心10 min，见试管中液体自上至下分为血浆层、白膜层、淋巴细胞分离液层和红细胞层。使用毛细吸管将白膜层中的单个核细胞吸出来，置于清洁的试管中，加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤，弃上清。再次加入PBS洗涤，弃上清，得到所需的PBMCs。然后，加入荧光标记的抗细胞表面特异性抗原(抗CD3-FITC、抗CD11b-FITC、抗CD14-PE、抗CD34-FITC、抗HLA-DR-ECD，美国BD公司)各5μl，4℃下孵育45 min，重复操作一次。使用美国CytoFLEX公司LX型流式细胞仪检测PBMC中NKp46+ILC3细胞百分比；
取分离得到的PBMCs，分别加入抗CD3和抗CD4抗体(美国BD公司)，4℃下避光孵育30 min。加入PBS洗涤，4℃下1000 r/m离心5 min，弃上清，再次加入PBS洗涤，弃上清。加入破膜/洗涤缓冲液100μl进行细胞打孔，室温下避光孵育5 min，加入PBS洗涤，4℃下1000 r/m离心5 min，弃上清，重复该步骤一次，加入破膜/洗涤缓冲液100μl，并加入PE标记的抗IL-17抗体(美国eBioscience公司)5μl，室温下避光孵育30 min，加入PBS溶液，静置30 min，每10 min置于涡旋震荡仪上振荡混匀1次，充分混匀。上机检测PBMC中Th17细胞百分比。

1.3 肝组织学检查 在超声引导下进行肝穿刺活检，常规行病理学检查，依据Knodell组织学活动度指数计分系统进行炎症活动度分级[7]。

2.1 不同病情AIH患者外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细胞水平比较 重度AIH患者外周血NKp46+ILC3细胞百分比显著低于轻中度AIH患者，而Th17/CD4+T细胞百分比显著高于轻中度AIH患者，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 不同病情AIH患者外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细百分比比较

2.2 不同肝组织炎症活动分级AIH患者外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细胞百分比比较 肝组织炎症活动G3～4级AIH患者外周血NKp46+ILC3细胞百分比显著低于G1～2级AIH患者，而Th17/CD4+T细胞百分比显著高于G1～2级AIH患者，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.3 外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细胞百分比判断AIH患者肝组织炎症活动分级的效能分析 以外周血NKp46+ILC3细胞百分比≤0.3%为截断点，判断AIH患者肝组织炎症重度活动的AUC为0.774(95% CI：0.592～0.957)，其敏感度为75.0%，特异度为87.1%；
以外周血Th17/CD4+T细胞百分比>1.1%为截断点，判断AIH患者肝组织炎症重度活动的AUC为0.853(95% CI：0.734～0.973)，其敏感度为66.7%，特异度为90.3%(图1)。

图1 外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细胞百分比判断AIH患者肝组织炎症活动分级的ROC曲线

AIH是一种自身免疫炎症性慢性肝病。随着男性患者比例的相对增加，其发病率呈升高趋势[8]。尽早对AIH患者进行诊断和干预，有助于促进患者良好转归，提升患者生活质量。但到目前为止，有关AIH的发病机制尚无明确的结论。ILCs是一组异质性的免疫细胞，具有与辅助性T细胞相似的表型和功能，但不表达T细胞和B细胞的抗原特异性受体[9]。ILCs细胞主要分泌白介素-17、IL-22和干扰素-γ等，从而参与组织修复和抵御病原体入侵[10]。在正常情况下，ILC3细胞比例较低。一旦组织受到损害，ILCs能够迅速启动免疫应答，上调ILC3表达，并促进IL-17和IL-22分泌和释放，从而对组织起到保护和修复作用[11]。最近的研究认为，ILC3细胞在自身免疫性疾病[12]、炎症性肠病[13]和肝纤维化[5]等多种疾病发生发展过程中起着重要作用。NKp46+ILC3淋巴细胞亚群对肺和肠道炎症具有保护作用[14]。本研究结果显示，重度AIH患者外周血NKp46+ILC3细胞百分比显著低于轻中度AIH患者，提示外周血NKp46+ILC3细胞水平与AIH患者病情严重程度密切相关。NKp46+ILC3细胞能够发挥促进肝细胞再生和修复作用，故其水平越低，患者临床病情越严重。同时，本研究结果还显示，与肝组织炎症活动G1～2级AIH患者相比，G3～4级AIH患者外周血NKp46+ILC3细胞百分比显著降低，表明外周血NKp46+ILC3细胞水平能够在一定程度上反映AIH患者肝组织炎症活动分级。研究表明，支气管和肺发育不良小鼠肺组织NKP46-ILC3细胞比例显著高于对照组，且IL-17和IL-22表达亦显著高于对照组，提示ILC3可能是通过分泌IL-17在支气管和肺发育不良方面发挥促炎作用[15]。肝脏炎症可导致NKp46+ILC3细胞水平降低，其比例降低将导致机体免疫功能紊乱，使得该细胞无法发挥促进肝细胞再生和修复作用，继而加重肝组织损伤。本研究经ROC曲线分析结果显示，应用外周血NKp46+ILC3细胞百分比判断AIH患者肝组织炎症活动G3～4级的AUC为0.774，提示其具有较高的效能。

Th17细胞是一种可分泌IL-17的T细胞亚群，可促进IL-6、IL-8和IL-23等炎性细胞因子，进而在炎症和自身免疫性疾病发病方面发挥重要作用[16]。Th17/Treg细胞免疫平衡以及相关炎性细胞因子IL-6和IL-17等表达失调可能参与酒精性肝损伤的发生发展过程[17]。Th17/Treg细胞失衡与乙型肝炎肝硬化的发病密切相关[18]。通过调节Th17/Treg细胞亚群平衡，有助于减轻肝细胞免疫损伤，降低对肝组织的损害[19]。本研究结果显示，重度AIH患者外周血Th17/CD4+T细胞百分比显著高于轻中度AIH患者。同时，肝组织炎症活动G3～4级AIH患者外周血Th17/CD4+T细胞百分比显著高于G1～2级AIH患者，提示Th17细胞水平可能与AIH的发生发展存在关联。文献报道[20]也认为，Th17细胞水平与慢性丙型肝炎患者肝脏炎症程度呈正相关。AIH患者Th17细胞水平升高，导致其分泌释放的IL-6和IL-17等细胞因子增加，从而加重肝脏炎症程度，Th17细胞和肝细胞之间的正反馈调节加剧了肝脏炎症过程。故AIH患者Th17细胞水平失衡诱发机体炎症反应，进而导致肝脏炎性受损。经ROC曲线分析结果亦显示，应用外周血Th17/CD4+T细胞百分比判断AIH患者肝组织炎症活动G3～4级的效能较高。因此，检测外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细胞水平变化有助于判断AIH患者肝组织炎症活动分级，相对于肝脏穿刺活检术，采集患者外周静脉血检测易于操作，且具有无创性和可重复性，能够用于临床动态监测。有研究[21]认为，AIH患者对治疗应答不同，快速应答患者可能与其肝组织损伤较轻有关。今后的研究工作尚需纳入更多样本量并对不同治疗时间应答AIH患者外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细胞水平进行分析，以探究NKp46+ILC3细胞和Th17细胞在AIH发病过程中的作用。

综上所述，AIH患者外周血NKp46+ILC3细胞水平降低，而Th17细胞水平升高。检测外周血NKp46+ILC3细胞和Th17细胞水平有助于判断AIH患者肝组织炎症活动分级，对AIH患者病情评估具有一定的临床意义。本研究纳入病例数较少，其结论需多中心研究数据的支持和论证。