基于高通量测序揭示臭咸鸡蛋及其发酵液微生物多样性

袁宇涵，王岩，金泽林，张亮，王亮，刘云国*

(1.新疆大学 生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；
2.临沂大学 生命科学学院，山东 临沂 276000；
3.临沂小鲁生物科技有限公司，山东 临沂 276000)

臭咸鸡蛋作为一种传统的发酵蛋制品，产地主要集中在我国北京、山东等地。由于其独特的风味以及易于携带、食用方便的特点，臭咸鸡蛋深受老百姓的喜爱。臭咸鸡蛋与臭豆腐、臭鳜鱼等特色小吃有异曲同工之妙，都是通过自然发酵与时间相结合而产生的美味，吃后让人流连忘返、回味无穷[1]。臭咸鸡蛋主要是通过盐、碱等不同辅料加工腌制处理而成，然而其生产方式目前只有通过家庭式小作坊来进行自然腌制，市场上还没有形成生产臭咸鸡蛋的产业链。随着人们生活水平的日益提高，特色小吃逐渐引起人们的注意，为实现臭咸鸡蛋的产业化，确定其发酵优势菌种，从而阐述优势微生物与风味之间的发展关系变得至关重要。

发酵食品通常是由原料本身及环境微生物的共同作用来赋予其独特的风味[2]，风味是发酵食品的一个非常重要的质量属性，它关系到消费者的接受程度，微生物群落在发酵过程中对形成风味物质起着至关重要的作用[3-4]。研究表明，在发酵过程中，许多微生物(乳杆菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、魏斯氏菌)会在发酵过程中产生大量的风味成分[5-8]。高通量测序是一种不依赖培养的新型方法，已成为表征微生物群落的α和β多样性的主要方法[9]，该方法结合基因组测序和生物信息学分析，能够同时检测优势种属、稀有种属和部分未知种属，揭示微生物群落构成，并对优势物种进行差异分析[10]。因此，本研究采用高通量测序来揭示发酵臭咸鸡蛋与发酵液中的微生物群落，分析了原料微生物与环境微生物的相关性，这些发现可能为改善臭咸鸡蛋的风味和整体质量提供有价值的参考。

1.1 材料与试剂

发酵臭咸鸡蛋由中国山东潍坊地区农户家庭自行腌制，并运往实验室。在无菌条件下，取臭咸鸡蛋样品与发酵液样品，分别编号为egg-1、egg-2、souse-1，并放置于-20 ℃冰箱中保藏备用。

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit：Omega公司；
Qubit 3.0 DNA检测试剂盒:Life公司；
2×Hieff®Robust PCR Master Mix、Hieff NGS®DNA Selection Beads:Yeasen公司。

1.2 仪器与设备

Pico-21台式离心机 Thermo Fisher公司；
GL-88B漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；
TND03-H-H混匀型干式恒温器 深圳拓能达科技有限公司；
电泳仪 北京市六一仪器厂；
FR-1000凝胶成像系统 上海复日科技有限公司；
Q32866 Qubit 3.0荧光计 Invitrogen公司；
ETC811 PCR仪 北京东胜创新生物科技有限公司；
Research Plus 0.5～10 μL移液器 Eppendorf公司。

1.3 DNA的提取

采用Omega E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取试剂盒提取基因组 DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，利用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒定量检测DNA样本浓度。

1.4 扩增及测序

以稀释后的基因组DNA为模板，采用特异性引物341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACT-ACHVGGGTATCTAATCC)扩增16S基因的V3～V4区序列，采用引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGG-AAGTAA)和ITS2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)扩增ITS1和ITS2序列。经过两轮扩增后用1×TAE浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测文库大小，文库浓度测定在Qubit 3.0荧光定量仪上进行，最后由生工生物工程(上海)股份有限公司在Illumina MiSeq平台上对文库进行测序。

2.1 物种丰富度和多样性

2.1.1 细菌丰富度与多样性

从3个样品中共获得了153 911条原始序列，见表1。经过滤后，共获得123 713条高质量有效序列。所有样本的覆盖率至少为99.9%，表明测序样本中几乎所有的细菌都可以被检测到。在3个样本中，观察到的OTUs数量为65～94个，在发酵液中样品达到最高水平。采用Chao1指数测定各样品的细菌群落丰度， Shannon指数估算各样品的细菌群落多样性。显然，两个鸡蛋的Chao1、Ace和Shannon指数均低于发酵液。由表1可知，鸡蛋的Chao1值在72.5～90之间，发酵液的Chao1值为95.2。鸡蛋的Shannon指数在1.473 721～1.433 256之间，发酵液的Shannon指数为2.084 914。3个指标的变化表明，在发酵完全后，发酵液中细菌群落的丰富度和多样性明显高于egg-1、egg-2，表1显示了每个样品的分析读数。稀释曲线趋于平坦，反映了测序数据的合理性，见图1中a。

表1 16S rDNA测序α多样性分析Table 1 α diversity analysis for 16S rDNA sequencing

2.1.2 真菌丰富度与多样性

从3个样品中共获得了215 834条原始序列，经过滤后，共获得155 133条高质量有效序列，见表2。所有样本的覆盖率均在99.9%以上，说明测序结果可靠，样品中的序列几乎全部被检测出。值得注意的是，发酵液真菌的Ace、Chao1、Shannon指数均明显高于细菌，说明发酵液中真菌群落的丰富度和多样性明显高于细菌群落。随着测序条数的增加，曲线逐渐趋于平缓，说明测序数据合理，可真实反映真菌群落的多样性，见图1中b。

表2 ITS测序α多样性分析Table 2 α diversity analysis for ITS sequencing

图1 稀释曲线

2.2 微生物群落组成

采用扩增子测序方法进行分析。由图2可知，在3个样品中共鉴定出7个细菌门，其中相对丰度>0.1%的有放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)。其中egg-1、egg-2中厚壁菌门相对丰度高达91.44%和94.83%，变形菌门相对丰度为7.72%和4.24%，其余细菌门相对丰度总值不及1%。但在发酵液中，变形菌门为优势类群，相对丰度为63.71%，厚壁菌门则占30.06%。厚壁菌门和变形菌门是鸡蛋及其发酵液中的两个主要微生物菌群，其相对丰度在93%以上。

图2 门水平上各样品中细菌群落的相对丰度和组成Fig.2 Relative abundance and composition of bacterial community in various samples at the level of phylum

图3 属水平上各样品中细菌群落的相对丰度和组成Fig.3 Relative abundance and composition of bacterial community in various samples at the level of genus

图4 门水平上各样品中真菌群落的相对丰度和组成Fig.4 Relative abundance and composition of fungal community in various samples at the level of phylum

图5 属水平上各样品中真菌群落的相对丰度和组成Fig.5 Relative abundance and composition of fungal community in various samples at the level of genus

在属水平上，鸡蛋与发酵液菌群种类与丰度差异较大，在不同样品中共鉴定出79个属。由图3可知，鸡蛋中主要优势属为盐厌氧菌属(Halanaerobium)，在egg-1和egg-2中相对丰度分别达到69.51%和54.24%，而在发酵液中则为14.97%。与鸡蛋相比，发酵液中盐厌氧菌属的含量明显降低。盐厌氧菌属是一类严格厌氧的细菌[11]，在发酵后期，鸡蛋内环境属于厌氧发酵状态，有利于盐厌氧菌属的大量繁殖，而发酵液环境复杂，可能对其产生了限制。已有文献证明盐厌氧菌属在传统腐乳、虾酱、鱼露的发酵过程中起着巨大的作用[12-14]。鸡蛋中第二大优势菌群为海藻乳酸菌(Marinilactibacillus)，相对丰度分别为17.8%和37.04%，作为嗜盐嗜碱乳酸菌，海藻乳酸菌广泛分布在环境、腌制肉制品与乳制品中[15-17]，值得注意的是，在发酵液中海藻乳酸菌相对丰度仅有0.06%。肠杆菌属是常见的致病菌属[18]，在本次研究中，egg-1和egg-2中均检测到肠杆菌属(Enterobacter)，而在发酵液中几乎没有检测到。相对于发酵液来说，鸡蛋中营养物质丰富，肠杆菌属细菌更易通过氧化多种简单有机化合物或发酵糖、有机酸或多元醇来获取能量，因此，在发酵过程中对于时间的把控要格外注意，不仅追求质量的提升，更要注意健康和安全。在发酵液中盐单胞菌属(Halomonas)为优势属，相对丰度为47.17%，据报道，盐单胞菌属广泛存在于水体环境中，这与我们的研究结果一致[19-20]。海杆菌属(Marinobacter)在鸡蛋中相对丰度极低，而在发酵液中作为第三大优势菌群，相对丰度为14.27%。泰式菌属(Tissierella)主要存在于人体胃肠道与动物粪便中[21]，在egg-1、egg-2中均没有检测出，是发酵液中特有的细菌群落，约占9.11%。

由图4可知，ITS 测序分析表明，在真菌门水平上，共鉴定出8个真菌门，值得注意的是，3个样品中子囊菌门(Ascomycota)均具有极高的相对丰度，其中egg-1中相对丰度最高，占97.37%。担子菌门(Basidiomycota)虽然作为第二大真菌群落，但在3个样品中最高也仅有5.47%，发酵液中担子菌门相对丰度略高于egg-1、egg-2。

在属水平上，共鉴定出118个属，由图5可知，发酵液真菌群落的丰富度和均匀度明显高于egg-1、egg-2。3组样品中占优势的主要是帚枝霉属(Sarocladium)，但相对丰度有所差异，在41.15%～70.89%之间，帚枝霉属是一种常见的内生菌，直到最近才被认为与部分腐败疾病的引起是低相关性的[22]，并且具有一定的生物防治潜力，可以作为一种有效的抗致病菌生物防治剂[23]。迈耶氏酵母属(Meyerozyma)在3个样品中均存在，但egg-1略高于egg-2和发酵液。发酵液中有孢圆酵母属(Torulaspora)相对丰度为9.61%，而在egg-1中仅有0.27%，研究表明，酵母可以直接利用葡萄糖、果糖发酵，经历一系列复杂的生物化学反应，这也是产生臭咸鸡蛋特有气味的原因之一。节菱孢属(Arthrinium)和耐干霉菌属(Xeromyces)是发酵液中独特的微生物群落，在其余两个样品中均未检测到。

图6 微生物群落热图Fig.6 Heat map of microbial community

由图6可知，热图显示了3个样品微生物群落组成和动态的差异，相对丰度用从浅色(最低相对丰度)到深色(最高相对丰度)的颜色强度来表示。综上所述，主要优势细菌盐厌氧菌属在3个样品中均大量存在。发酵液中盐单胞菌属、海杆菌属、泰式菌属相对丰度显著高于鸡蛋。对于真菌来说，帚枝霉属、有孢圆酵母属、迈耶氏酵母属在3个样品中均具有较高的相对丰度。而毕赤酵母属、威克汉姆酵母属、被孢霉属、节菱孢属、耐干霉菌属和枝孢属在发酵液中表现出比egg-1、egg-2高的相对丰度。

本研究评价了发酵臭咸鸡蛋与发酵液中微生物群落动态变化。高通量测序分析结果显示，在egg-1、egg-2中优势细菌属有盐厌氧菌属、海藻乳酸菌，其中盐厌氧菌属占有极高的相对丰度，为绝对优势菌属。优势真菌属有帚枝霉属、迈耶氏酵母属和有孢圆酵母属。在发酵液中盐单胞菌属为最优势细菌属，海杆菌属、泰式菌属为其特有细菌属。迈耶氏酵母属、有孢圆酵母属、毕赤酵母属、被孢霉属、节菱孢属、耐干霉菌属在发酵液中均具有一定的相对丰度，说明发酵液中微生物分布较均匀。这些结果为后续发酵臭咸鸡蛋标准化、规范化的工业生产链及发酵用菌的筛选提供了数据支持，并有必要进一步将基因组学和代谢组学结合起来，分析发酵特征与代谢途径之间的关系，进一步探讨发酵机制。