低氧环境下菊苣酸对SD大鼠脂肪组织抗氧化能力、炎性因子及能量代谢的影响

行倩文，吴 华，刘嘉华，刘 波，张龙飞，陈鑫磊，王文胜

(青海大学 农牧学院，青海 西宁 810016)

氧气为动物机体所必需的物质，参与ATP合成，为维持动物机体正常生命活动及新陈代谢过程提供能量[1]。低氧适应是动物机体克服低氧，在低氧适应环境中最大程度的从体内和外界的环境中充分摄取并能够充分利用低氧环境空气中的水分和氧气，保证正常的机体自然生理功能的正常进行[2]。

菊苣酸(chicoric acid，CA)是一种天然酚类化合物，在植物中的分布比较广，主要存在于紫锥菊、菊苣等天然植物中[3]，具有抗氧化及清除自由基、抗炎、提高免疫力等作用[4]。本课题组前期研究表明，CA可加强放牧牦牛对营养物质的代谢，提高低氧条件下放牧牦牛线粒体活性，增强牦牛高海拔低氧适应性[5]。吴华等[6]研究发现添加CA能对牦牛机体适应高海拔、低氧环境，提高免疫力和抵抗炎性反应具有积极作用。

低氧是临床许多疾病共同的病理生理因素，长期慢性低氧对机体的损害是多方位的，其对机体的危害逐渐引起人们的重视。研究发现慢性低氧时机体可表现为脂肪代谢异常。然而，目前关于低氧环境下CA对SD大鼠脂肪组织抗氧化能力、炎性及能量代谢影响的研究鲜见报道。基于此，本试验拟在低氧环境下对SD大鼠饲喂不同浓度的CA，研究CA对于SD大鼠不同部位脂肪组织抗氧化能力、炎性及能量代谢水平的影响。以期为CA作为高海拔地区治疗炎症、提高抗氧化能力和作为维持能量代谢的饲料添加剂应用于畜禽生产的开发利用提供理论基础。

1.1 试验材料CA提取物购自西安锐博生物科技有限公司，为黄绿色精细粉末,成分：CA含量4%，其中CA(2.0%～2.2%)+咖啡酸(1.0%～1.5%)+绿原酸(0.5%～1.0%)+紫锥菊甙(0.3%～0.5%)；
超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、超微量Ca2+-ATP酶测试盒、超微量Na+K+-ATP酶测试盒、总蛋白(TP)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；
大鼠白细胞介素-6(IL-6)测定试剂盒、大鼠白细胞介素-10(IL-10)测定试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)测定试剂盒、脂联素(ADP)、干扰素-γ(IFN-γ)购自江苏酶免实业有限公司。

1.2 实验动物选取60只健康雄性SD大鼠(6～8周龄，170～220 g)购自青海喜马拉雅动物实验中心有限公司(动物许可证号：SCXK(陕)2018-001)，试验大鼠于青海省河南蒙古族自治县畜牧兽医工作站(海拔3 500 m，氧浓度13.65%[7])进行饲养。

1.3 试验分组与处理将60只大鼠于室温(21±2)℃、正常光照周期条件下进行饲养。将大鼠按照体质量随机分为4组(P>0.05)，每组15只。预饲2 周后，进行正式试验。第1组为对照组，每天上午9:00灌胃0.5 mL生理盐水，第2,3,4 组根据大鼠体质量分别灌胃0.5 mL含10，20，40 mg/kg CA的生理盐水。4组大鼠均自由采食和饮水。连续灌胃49 d后进行试验。

1.4 样品采集饲养结束后，禁食24 h，每组大鼠分别随机抽取6只，用10%水合氯醛进行腹腔麻醉。采集肝脏、皮下脂肪和附睾脂肪组织，分别放入2 mL冻存管，迅速置于液氮中，后移置-80℃保存，待测。

1.5 抗氧化能力指标、炎性因子含量及能量代谢水平指标的测定取SD大鼠肝脏、皮下脂肪和附睾脂肪组织，按每克待测组织加入9 mL生理盐水的比例处理，然后使用超声细胞破碎仪在冰水浴条件下制备匀浆，4℃、2 500 r/min离心10 min，取上清液分装，4℃保存，随后参照ELISA试剂盒说明测定抗氧化能力指标、炎性因子含量、能量代谢水平。

1.6 统计学分析经Excel初步处理数据后，采用统计软件 SPSS 23.0 对试验数据进行分析，试验结果采用Duncan"s法进行多重比较，GraphPad Prism 8.0软件进行绘图。

2.1 低氧环境下CA对SD大鼠抗氧化能力的影响如图1所示，肝脏组织：与对照组相比，10，20，40 mg/kg组CAT含量显著升高(P<0.05)，MDA含量极显著降低(P<0.01)，20，40 mg/kg组GSH-Px含量极显著升高(P<0.01)，SOD含量极显著升高(P<0.01)；
与10 mg/kg组相比，20，40 mg/kg组GSH-Px含量极显著升高(P<0.01)，20 mg/kg组SOD含量极显著升高(P<0.01)，40 mg/kg组SOD含量显著升高(P<0.05)；
与20 mg/kg组相比，40 mg/kg组CAT含量极显著升高(P<0.01)；
其余各组间差异不显著(P>0.05)。皮下脂肪组织：与对照组相比，10 mg/kg组CAT含量显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)，20，40 mg/kg 组CAT、GSH-Px含量极显著升高(P<0.01)，MDA含量极显著降低(P<0.01)，10，20，40 mg/kg 组SOD含量极显著升高(P<0.01)；
与10 mg/kg组相比，20，40 mg/kg组CAT含量显著升高(P<0.05)，GSH-Px含量极显著升高(P<0.01)，MDA含量显著降低(P<0.05)；
与20 mg/kg组相比，40 mg/kg组CAT、SOD含量显著升高(P<0.05)；
其余各组间差异不显著(P>0.05)。附睾脂肪组织：与对照组相比，10，20，40 mg/kg组GSH-Px、SOD含量极显著升高(P<0.01)，10 mg/kg组MDA含量显著降低(P<0.05)，20，40 mg/kg组CAT含量极显著升高(P<0.01)，MDA含量极显著降低(P<0.01)；
与10 mg/kg组相比，20，40 mg/kg 组GSH-Px、SOD含量极显著升高(P<0.01)，40 mg/kg组CAT含量极显著升高(P<0.01)，MDA含量显著降低(P<0.05)；
与20 mg/kg相比，40 mg/kg组CAT含量极显著升高(P<0.01)，40 mg/kg组MDA含量显著降低(P<0.05)；
其余各组间差异不显著(P>0.05)。

不同小写字母表示 P<0.05，不同大写字母表示 P<0.01。下同

2.2 低氧环境下CA对SD大鼠炎性因子的影响如图2所示，肝脏组织：与对照组相比，10，20，40 mg/kg 组IL-10含量极显著升高(P<0.01)，IFN-γ含量极显著降低(P<0.01)，20，40 mg/kg组TNF-α含量极显著降低(P<0.01)，40 mg/kg组IL-6含量极显著降低(P<0.01)；
与10 mg/kg组相比，20，40 mg/kg组IL-10含量极显著升高(P<0.01)，TNF-α含量极显著降低(P<0.01)，40 mg/kg组IL-6、IFN-γ含量极显著降低(P<0.01)；
与20 mg/kg 组相比，TNF-α、IL-6、IFN-γ含量极显著降低(P<0.01)；
其余组间差异不显著(P>0.05)。皮下脂肪组织：与对照组相比，10，20，40 mg/kg组IL-10含量极显著升高(P<0.01)，TNF-α、IL-6含量极显著降低(P<0.01)，10 mg/kg组IFN-γ含量显著降低(P<0.05)，20，40 mg/kg组IFN-γ含量极显著降低(P<0.01)；
与10 mg/kg组相比，40 mg/kg 组IL-10含量极显著升高(P<0.01)，20，40 mg/kg组TNF-α、IL-6、IFN-γ含量极显著降低(P<0.01)；
与20 mg/kg组相比，40 mg/kg组IFN-γ含量显著降低(P<0.05)；
其余组间差异不显著(P>0.05)。附睾脂肪组织：与对照组相比，10，20，40 mg/kg组IL-10含量极显著升高(P<0.01)，40 mg/kg 组TNF-α含量显著降低(P<0.05)，20，40 mg/kg组IL-6、IFN-γ含量极显著降低(P<0.01)；
与10 mg/kg组相比，20 mg/kg组IFN-γ含量极显著降低(P<0.01)，40 mg/kg组TNF-α、IFN-γ含量显著降低(P<0.05)；
与20 mg/kg组相比，40 mg/kg组TNF-α含量显著降低(P<0.05)；
其余组间差异不显著(P>0.05)。

图2 低氧环境下CA对SD大鼠炎性因子的影响

2.3 低氧环境下CA对SD大鼠能量代谢水平的影响如图3所示，肝脏组织：与对照组相比，40 mg/kg组Ca2+-ATP酶含量极显著升高(P<0.01)，20，40 mg/kg组Na+K+-ATP酶、ADP含量极显著升高(P<0.01)；
与10 mg/kg组相比，40 mg/kg组Ca2+-ATP酶含量极显著升高(P<0.01)，20，40 mg/kg 组Na+K+-ATP酶、ADP含量极显著升高(P<0.01)；
与20 mg/kg组相比，40 mg/kg组Ca2+-ATP酶、ADP含量极显著升高(P<0.01)；
其余组间差异不显著(P>0.05)。皮下脂肪组织：与对照组相比，40 mg/kg组Ca2+-ATP酶含量极显著升高(P<0.01)，Na+K+-ATP酶含量显著升高(P<0.05)，10，40 mg/kg组ADP含量显著升高(P<0.05)，20 mg/kg组ADP含量极显著升高(P<0.01)；
与10 mg/kg组相比，40 mg/kg组Ca2+-ATP酶含量极显著升高(P<0.01)，Na+K+-ATP酶含量显著升高(P<0.05)，20 mg/kg组ADP含量极显著升高(P<0.01);与20 mg/kg组相比，40 mg/kg 组Ca2+-ATP酶含量极显著升高(P<0.01)，Na+K+-ATP酶含量显著升高(P<0.05);其余组间差异不显著(P>0.05)。附睾脂肪组织：与对照组相比，10，20，40 mg/kg组Ca2+-ATP酶含量极显著升高(P<0.01)，20，40 mg/kg组Na+K+-ATP酶、ADP含量极显著升高(P<0.01)；
与10 mg/kg 组相比，20，40 mg/kg组ADP含量极显著升高(P<0.01);其余组间差异不显著(P>0.05)。

图3 低氧环境下CA对SD大鼠能量代谢水平的影响

氧气作为生命之源，维持动物机体正常生命活动及新陈代谢过程，在内环境稳态中发挥着重要的作用。有研究表明海拔3 000 m以上的地区为高原低氧环境，地区氧浓度低于正常水平，对动物机体的血液、呼吸系统造成严重的影响，甚至引起机体组织器官损伤[8]。

3.1 低氧环境下CA对SD大鼠脂肪组织抗氧化能力的影响正常情况下，体内氧化体系与抗氧化体系维持着动态平衡，当机体在某种刺激的影响下，细胞内活性氮簇、活性氧簇等高活性分子生成增多,使抗氧化和氧化机制之间的平衡状态被打破，导致组织损伤[9]。MDA是脂质过氧化作用的主要产物之一，能够反映脂质过氧化作用的水平。SOD能清除超氧化自由基，防止细胞损伤，其活性可以直接反映细胞对氧自由基的清除能力，在维持组织细胞氧化和抗氧化平衡中起关键作用[10-11]。SOD和CAT是生物体应对氧化损伤的重要抗氧化酶，SOD将生物自身代谢或外界胁迫下产生的一系列有毒物质转化为过氧化氢，而CAT作为过氧化氢的清除剂，可将过氧化氢还原成氧分子和水[12]，从而维持细胞和机体的正常生理活动。GSH-Px特异催化GSH对H2O2的还原反应，起保护细胞膜结构和功能完整的作用[13]。本试验结果表明，低氧环境下对SD大鼠灌喂不同浓度的CA，与对照组相比，在肝脏、皮下脂肪、附睾脂肪组织中，20，40mg/kg组CAT、SOD、GSH-Px含量均显著升高(P<0.05)，MDA含量均显著降低(P<0.05)。不同试验组比较，20 mg/kg组肝脏组织GSH-Px含量均显著增加(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)，皮下脂肪组织GSH-Px含量均显著增加(P<0.05)，附睾脂肪组织SOD含量显著增加(P<0.05)，20，40 mg/kg组肝脏组织CAT、SOD含量显著增加(P<0.05)，皮下脂肪组织MDA含量显著降低(P<0.05)，附睾脂肪组织GSH-Px含量显著增加(P<0.05)，40 mg/kg皮下脂肪组织CAT、SOD含量均显著增加(P<0.05)，附睾脂肪组织CAT含量显著增加(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。说明低氧环境下，CA通过清除SD大鼠脂肪组织超氧化自由基，加快过氧化氢还原成氧分子和水，降低脂质过氧化对脂肪组织的损伤，提高SD大鼠肝脏、皮下脂肪、附睾脂肪组织抗氧化能力，进而维持低氧环境下SD大鼠体内抗氧化系统动态平衡，且40 mg/kg组作用效果最好。

3.2 低氧环境下CA对SD大鼠脂肪组织炎性因子的影响低氧可以诱导机体发生炎症反应，分泌大量炎症因子，如促炎因子TNF-α、IL-6及抑炎因子IL-10等。其中IL-6是重要的促炎因子，其由巨噬细胞、成纤维细胞等产生[14]，是介导炎症反应的重要细胞因子，是机体发生感染的重要指标[15]。TNF-α是机体炎症反应的起始因子，是激活细胞因子级联反应的主要介质，一旦释放很快引起次级因子IL-6的大量产生[16-17]。IL-10主要由辅助性T淋巴细胞(Th)2细胞产生，介导调节Th1/Th2细胞平衡[18]，抑制促炎因子合成释放，促炎因子与抑炎因子相互作用，维持体内炎性反应和免疫反应平衡[19]。IFN-γ同TNF-α是炎症反应激活的关键转录因子[20]。低氧刺激下，IFN-γ和TNF-α可以激活细胞质中的NF-κB复合物易位至细胞核，并参与众多促炎基因的表达[21]。本试验结果表明，与对照组相比，在肝脏、皮下脂肪、附睾脂肪组织中，不同CA浓度组均显著升高IL-10含量(P<0.05)；
20，40 mg/kg 组均显著降低IL-6、TNF-α、IFN-γ含量(P<0.05)。不同试验组比较，20，40 mg/kg组肝脏组织IL-10含量显著增加(P<0.05)，皮下脂肪组织TNF-α、IL-6含量显著降低(P<0.05)，附睾脂肪组织IL-6、IFN-γ含量显著降低(P<0.05)；
40 mg/kg组肝脏组织TNF-α、IL-6、IFN-γ含量显著降低(P<0.05)，皮下脂肪组织IL-10含量显著增加(P<0.05)，IFN-γ含量显著降低(P<0.05)，附睾脂肪组织IL-10含量显著增加(P<0.05)，TNF-α含量显著降低(P<0.05)。说明低氧环境下，CA通过增加SD大鼠脂肪组织抑炎因子IL-10含量，降低促炎因子TNF-α、IL-6含量和IFN-γ表达量，提高SD大鼠肝脏、皮下脂肪、附睾脂肪抗炎能力，保护SD大鼠肝脏、皮下脂肪、附睾脂肪组织因低氧而造成的炎性反应，且40 mg/kg组作用效果最好。

3.3 低氧环境下CA对SD大鼠脂肪组织能量代谢的影响脂联素(ADP)在细胞葡萄糖和脂肪酸等能量代谢过程中发挥重要的调节作用，并参与细胞增殖肥大和免疫功能的调控[22]。其还在内分泌、代谢和炎症信号方面起作用，并控制能量的稳态[23]。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶是细胞膜上重要的酶蛋白，这两种蛋白酶基因起源相同，此外还有相似的结构功能，能主动将Ca2+、Na+运送到细胞外，摄入K+。Na+-K+-ATP酶是将细胞膜内Na+移到细胞外，同时将细胞外的K+移入膜内，从而形成2种离子的分布不平衡；
Ca2+-Mg2+-ATP酶的作用是将Mg2+移入胞内，将Ca2+移到细胞外，维持内环境的相对稳定[24]。大鼠在低氧暴露环境训练，骨骼肌线粒体产生的大量氧自由基作用于线粒体膜引起膜脂质过氧化，影响Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，导致其活性下降[25]。也有研究表明，急性低氧应激使大鼠线粒体游离钙浓度下降[26]，并使大鼠心肌线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力较正常大鼠显著降低[27]。线粒体内Ca2+增加会激活线粒体脱氢酶和刺激线粒体呼吸，从而产生ATP以满足能量的需求[28]。线粒体是细胞内重要的钙储存库，线粒体膜上的ATP酶是调节和维持细胞内线粒体钙稳态的关键因素。Na+-Ca2+跨膜转运是利用Na+-K+-ATP酶产生的电化学梯度作为能源。低氧可抑制线粒体的氧化磷酸化过程,使能量代谢发生障碍，同时线粒体摄钙能力下降，导致胞质中Ca2+浓度升高,最终引起心肌损伤[29]。线粒体内Ca2+增加会激活线粒体脱氢酶和刺激线粒体呼吸,从而产生ATP以满足能量的需求[28]。本试验结果表明，与对照组相比，在肝脏、皮下脂肪、附睾脂肪组织中20 mg/kg组均显著升高ADP含量(P<0.05)，40 mg/kg组均显著升高Na+K+-ATP 酶、Ca2+-ATP酶含量(P<0.05)。不同试验组间比较，20，40 mg/kg组肝脏组织Na+K+-ATP酶含量显著增加(P<0.05)，皮下脂肪组织ADP含量显著增加(P<0.05)，附睾脂肪组织Ca2+-ATP酶、Na+K+-ATP酶、ADP含量显著增加(P<0.05)，40 mg/kg组肝脏组织Ca2+-ATP酶、ADP含量显著增加(P<0.05)，皮下脂肪组织Ca2+-ATP酶、Na+K+-ATP酶含量显著增加(P<0.05)。说明低氧环境下，CA通过升高ADP的含量维持SD大鼠脂肪组织内能量的稳态，升高Na+K+-ATP 酶、Ca2+ATP 酶的含量，激活线粒体脱氢酶和刺激线粒体呼吸，产生较多的ATP以满足能量的需求，促进脂肪组织中线粒体的氧化磷酸化过程，使SD大鼠脂肪组织能量代谢恢复至正常水平，维持内环境的相对稳定。从而维持SD大鼠肝脏、皮下脂肪、附睾脂肪组织在低氧环境下的能量代谢平衡，且40 mg/kg组作用效果最好。

综上所述，CA通过提高低氧环境下SD大鼠肝脏、皮下脂肪和附睾脂肪组织GSH-Px、CAT、SOD含量，降低MDA含量，增强其抗氧化能力，提高脂肪组织IL-10含量，降低IL-6、TNF-α、IFN-γ含量，抑制机体炎症的发生以及升高脂肪组织Ca2+-ATP酶、Na+K+-ATP酶、ADP含量，加强其能量代谢水平，进而提高SD大鼠低氧适应能力，且以40 mg/kg组作用最佳。为CA作为高海拔地区治疗炎症、提高抗氧化能力和作为维持能量代谢的饲料添加剂应用于畜禽生产的开发利用提供理论基础。