酱香型大曲贮存初期微生物及风味物质变化的分析研究

沈世明，何猛超，刘桂珍，潘学森，王邦坤，张娇娇，陈禹锜，5，阿如汗，刘金龙，韩兴林

（1.河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄 050018；
2.山东青州云门酒业（集团）有限公司，山东青州 252500；
3.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015；
4.国家酒类品质与安全国际联合研究中心，北京 100015；
5.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530004）

中国白酒历史悠久，源远流长，是我国特有的传统酒种之一，深受广大消费者的喜爱[1-2]，是以粮谷原料，结合大曲、小曲、麸曲作为糖化发酵剂，经过蒸煮、糖化、蒸馏而成的蒸馏酒。大曲在整个白酒发酵过程中占据举足轻重的作用，根据其制作工艺和温度可分为高温大曲、中高温大曲、中温大曲。不同大曲参与酿造的白酒香型有所不同，不同大曲中富含的微生物各不相同，功能也有所差异[3]。

高温大曲在制作过程中微生物极为丰富，对温度、湿度等指标要求极为严格，主要分为培养和贮存两个阶段，是功能微生物的定向及其相应代谢产物、酶类调控的关键过程。大曲贮存过程是最关键、最复杂的环节，主要体现在微生物的差异上，不同时期曲坯的微生物种类和数量呈动态变化趋势，在外界环境胁迫作用下（特别是温度）不断演替而逐渐平衡，最后微生物种类趋于平稳，数量变化较小，形成质量稳定、风味独特的酱香型高温大曲。HU 等[5]揭示了白云边高温大曲140 d 周期内的变化趋势，结果表明，高温期时耐热微生物是优势菌，贮存期时的温度相对稳定，但微生物的群落结构变化显著，贮存后，群落演变得更适合白酒多边发酵，不愉快的风味物质消失，独特风味物质增多。宋瑞滨等[6]通过研究浓香型大曲在贮存6 个月、12 个月、18 个月、24 个月不同贮存期理化指标与微生物数量以及所产酒质的变化规律，为提高制曲质量、提升酒体风格打好了坚实基础。迄今为止对高温大曲在贮存初期微生物的演替以及酱香风味物质的相关性研究鲜有报道，本研究旨在为企业提供科学的高温大曲最佳贮存时间及进一步提升酱香型白酒品质。

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品制备和收集

大曲的制备：高温大曲，生产于山东青州云门酒业（集团）有限公司大曲生产曲房，分别取贮存初期0 d、30 d、60 d 的高温大曲，按照文献[7]所述方法从曲堆上、中、下层取样粉碎，混合均匀，每次取200 g，送至实验室保藏（4 ℃和-20 ℃）至检测。

1.1.2 试剂及耗材

无水乙醇、浓硫酸、氢氧化钠等（均为分析纯），天津市福晨化学试剂厂；
乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸戊酯等标准品（均为色谱纯），美国Sigma-Aldrich公司；
TAE 缓冲液，北京索莱宝科技有限公司；
引物，上海生物工程股份有限公司；
DNA Marker，Takara；
琼脂糖，南京生兴生物技术有限公司；
核酸染料Gengreen，上海赛百盛有限公司；
土壤DNA 提取试剂盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit），Omega Bio-Tek公司。

1.1.3 仪器设备

CP1502 电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；
HH-S6A 电热恒温水浴锅，北京利伟永兴仪器有限公司；
PX2 型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪，上海赛默生物科技有限公司；
DYY5 稳压电泳仪，北京六一仪器厂；
GeI Image System Tanon 1600 凝胶成像仪，上海天能科技有限公司；
微量分光光度计，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
Agilent 1200 高效液相色谱仪(紫外检测)，安捷伦科技（中国）有限公司；
AutoSystem XL 气相色谱仪，珀金埃尔默（中国）股份有限公司；
ICS-3000 离子色谱仪，戴安（中国）有限公司；
Clarns 600气相色谱质谱联用仪，珀金埃尔默（中国）股份有限公司；
BSA224S 电子分析天平，德国sartorius 公司；
固相微萃取头（2 cm 50/30 μ m DVB/CAR/PDMS），美国Supelco 公司；
Clarus 680-Clarus 600T 型气相色谱-质谱联用仪，Perkin Elmer公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大曲微生物群落组成检测

（1）总DNA 的提取[8-9]。称取不同类型高温大曲5 g 液氮速冻后迅速研磨。大曲总DNA 提取方法按照土壤DNA 提取试剂盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）说明书操作。为了保证所提取基因组的浓度及纯度，对其进行PCR 扩增及产物纯化，对细菌16S rRNA 基因的V3—V4 高变区进行扩增，所用引物为338F/806R（5ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3/5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3），对真菌的内部转录间隔区（ITS1）进行扩增，所用引物为ITS5F/ITS1R（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3/5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）。扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

（2）高通量测序。将检测合格样品送往苏州帕诺米克生物医药科技有限公司，通过高通量测序（Illumina Miseq PE250）平台进行高通量测序。

1.2.2 大曲风味物质检测

每组曲样中各取1.00 g 放入20 mL 顶空瓶，加入7.5 μ L 乙酸正戊酯内标溶液（质量浓度为0.8365 mg/g），在70 ℃条件下振摇15 min，萃取45 min，直接进样。

GC 条件：色谱柱为Elite WAX ETR（30 m×0.25 mm×0.5 μ m）；
升温程序，35 ℃保留2 min，以3 ℃/min升温至120 ℃，保留2 min，以5 ℃/min升温至200 ℃，以10 ℃/min 升温至230 ℃，保留5 min；
载气为高纯氦气（纯度99.999 %）；
载气流量1.0 mL/min；
不分流进样；
溶剂延迟时间1 min。MS 条件：离子源为电子轰击离子源；
离子源温度230 ℃；
传输线温度230 ℃。萃取头：50/30 μ m DVB/CAR/PDMS Stableflex（2 cm）。定性分析方法：未知化合物经计算机检索的同时与标准谱库对比鉴定，保留正负匹配度大于800 的组分。定量方法：根据内标峰面积与风味物质峰面积的比值，计算风味物质的相对浓度。

1.2.3 数据分析

每个样品至少3 次重复，实验数据以平均数±标准差（mean±SD）表示，显著性差异以p＜0.05 为标准。典范对应分析（Canonical correspondence analysis，CCA）和冗余分析（Redundancy analysis，RDA）采用CAVOCOV45软件。Spearman指数采用SPSS 25 软件分析，并采用Gephi 软件绘制形成气泡图。

利用Excel 2019、IBM SPSS Statistics 25 等统计软件进行数据处理和分析，利用Origin pro 2021、Excel 2019和网站https://www.omicstudio.cn/tool 进行作图。

2.1 大曲贮存过程中微生物群落结构变化

2.1.1 大曲贮存过程中细菌群落变化

表1 为高温大曲在贮存过程中的细菌群落α-多样性，在贮存0 d、30 d、60 d的大曲中细菌群落丰富度和多样性呈上升趋势，说明高温大曲在贮存过程中细菌群落的丰富度和多样性显著改变。

表1 贮存过程不同大曲微生物群落α-多样性指数差异

从图1a、图1b 可以看出，贮存0 d 时高温大曲的优势细菌在门水平上主要是变形杆菌门（Proteobacteria），占总丰度的72.32%，贮存30 d、60 d 高温大曲的优势细菌在门水平上主要是厚壁菌门（Firmicutes），分别占总丰度的94.68%、93.23%。在细菌属水平上，贮存0 d 时的优势细菌属是盐单胞菌属（Halomonas），而经过贮存30 d、60 d 后高温大曲的细菌群落发生显著变化，逐渐趋于稳定，在30 d时，盐单胞菌属（Halomonas）逐渐减少甚至消失，克氏假单胞菌（Kroppenstedtia）、枝芽孢菌属（Virgibacillus）、海洋杆菌属（Oceanobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）等对大曲、白酒香气贡献较突出的细菌微生物开始出现并逐渐成为优势菌属，尤其是芽孢杆菌属（Bacillus）在贮存30 d 时占总丰度的1.21%，贮存60 d 后变为14.27%。研究表明，芽孢杆菌属（Bacillus）能够产生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶来水解原料，形成丰富的发酵前体物质，有利于酱香风味物质的形成，是产酱香风味的重要贡献菌株，如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等发酵能生成如吡嗪类、酸类、芳香类等风味物质，为酱香型白酒赋予了独特风格，吡嗪类物质作为一种健康因子也是酱香型白酒优势风味物质之一。

图1 细菌门/属水平相对丰度图

2.1.2 大曲贮存过程中真菌群落变化

表2 所示为高温大曲在贮存过程中的真菌群落α-多样性，在贮存0 d、30 d、60 d 时真菌群落丰富度和多样性呈上升趋势，尤其在贮存0 d 到30 d时上升较为明显，贮存30 d 到60 d 时略微上升，这可能与贮存的温度与水分有关。

表2 贮存过程不同大曲微生物群落α-多样性指数差异

3 种不同贮存期的高温大曲共检出170 个真菌属OTU，如图2a、图2b 所示，贮存0 d、30 d、60 d 的优势真菌门是子囊菌门（Ascomycota），在属水平上贮存0 d、30 d、60 d 的优势真菌属分别是嗜热真菌属（Thermomyces）、嗜热子囊属（Thermoascus）、曲霉属（Aspergillus）。嗜热真菌属（Thermomyces）是酱香型白酒发酵过程及清香型白酒曲曲心的优势真菌，是白酒酿造过程中重要酶类的来源，大多能产生高活力且耐热的纤维素酶、蛋白酶等，有利于微生物的繁殖生长及产酒产香[12-13]。贮存30 d 后，丝衣霉菌属（Byssochlamys）、毕赤酵母属（Pichia）开始出现，毕赤酵母属属于耐高温酵母菌，是酒醅发酵过程中常见的能产乙醇和产酯的酵母菌属之一。当贮存60 d 后，曲霉属（Aspergillus）、丝衣霉菌属（Byssochlamys）有所减少，曲霉属（Aspergillus）逐渐趋于稳定。随着贮存时间的延长，微生物结构在真菌水平上也逐渐达到稳定合理，证明了大曲贮存的重要性。

图2 真菌门/属水平相对丰度图

2.2 大曲贮存初期风味物质变化

对不同贮存期（0 d、30 d、60 d）酱香型大曲进行风味物质检测，3 种大曲共确定了39 种风味物质，如表3 所示，共分为8 类，其中醇类6 种、酸类7种、醛类4 种、酮类2 种、吡嗪类2 种、酯类11 种、烯烃类2 种、芳香族类5 种。醇类物质中异戊醇含量相对较高，在0 d 时最高为2.880 μ g/g；
酸类物质中亚油酸含量相对较高，在60 d时最高为1.907 μ g/g，这可能与脂质的分解有关；
醛类物质中2-吡咯甲醛含量相对较高，在60 d时最高为1.309 μ g/g；
酮类物质中香叶基丙酮含量相对较高，在30 d 时最高为0.168 μ g/g；
吡嗪类物质中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量相对较高，在60 d 时最高为15.580 μ g/g，吡嗪类物质的形成可能与美拉德反应有关，可以赋予酱香型大曲坚果香和烘焙香等；
酯类物质中棕榈酸乙酯、3-羟基-2,2,4-三甲基戊基异丁酸酯、苯乙酸乙酯含量相对较高，均在60 d 时最高，分别为4.023 μ g/g、3.948 μ g/g、1.915 μ g/g；
烯烃类物质中2,3-壬二烯含量相对较高，在0 d 时最高为1.000 μ g/g；
芳香类物质中苯乙醇相对较高，在60 d 时最高为2.347 μ g/g。

表3 不同贮存时间大曲风味物质含量 (μ g/g)

2.3 贮存初期酱香型大曲风味物质的差异性分析

根据不同贮存时间酱香型大曲风味物质的种类和含量做韦恩图和聚类分析热图，如图3 所示。由图3a 可知，不同贮存时间（0 d、30 d、60 d）酱香型大曲风味物质的共同成分有24 种，占风味物质总种类的61.54%。进一步分析发现，贮存时间0 d 和30 d 大曲共同成分有4 种，贮存时间30 d 和60 d 大曲共同成分3 种，0 d 和60 d 共同成分有1 种，贮存时间0 d、30 d 和60 d 酱香型大曲的独有成分分别为1 种、3 种、3 种。由此可见，随着贮存时间的延长，不同贮存时间大曲中共同成分减少，部分风味物质发生了转化，但不同贮存阶段的酱香型大曲均有其特有的风味物质，与柳习月等[18]的研究结果一致。

由图3b 可知，贮存30 d 和60 d 的大曲聚为一类，贮存0 d的大曲单独聚为一类。在贮存过程中，正戊醇、仲戊醇、2-丁基辛醇、糖醇、亚麻醇等醇类物质含量上升，异戊醇含量下降；
亚油酸、草莓酸、异亚麻酸含量上升，癸酸和壬酸的含量下降；
醛酮类物质中只有癸醛含量下降；
吡嗪类物质中2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪含量均上升；
酯类物质中正己酸乙酯、3-羟基-2,2,4-三甲基戊基异丁酸酯、十五烷酸、2,6,10,14-四甲基甲酯、苯乙酸乙酯、丁酸庚酯、硬脂酸乙酯、棕榈酸乙酯、月桂酸乙酯、油酸乙酯等酯类含量上升，其余酯类含量下降；
贮存过程中烯烃类物质含量均下降；
芳香类物质中苯酚含量下降，其余物质含量上升。整体上看，贮存过程中大曲风味物质含量整体上升，60 d时最高。

由图3c 可知，在贮存过程中，大曲中醇类、酸类、醛类、吡嗪类、酯类、芳香类等物质含量均增加，除酮类物质在30 d 时最多外，其余风味物质均在60 d 时含量最高。风味物质中含量最高的三类分别是醇类、酯类和酸类。醇类物质含量范围为3.389～6.089 μ g/g，酸类物质含量范围为0.685～3.483 μ g/g，醛类物质含量范围为0.607～2.453 μg/g，酮类物质含量范围为0.020～0.267 μ g/g，吡嗪类物质含量范围为1.596～16.654 μ g/g，酯类物质含量范围为4.651～47.777 μ g/g，芳香类物质含量范围为0.810～4.782 μ g/g。

图3 不同贮存期大曲风味物质分析

2.4 贮存初期酱香型大曲微生物与其风味物质的关联性分析

酱香型高温大曲以小麦为原料，富含蛋白质和酶，在微生物的作用下产生各种风味物质。贮存是酱香型高温大曲的必要阶段，探究在贮存阶段大曲中微生物群落和风味物质的变化，有利于加深对酱香型高温大曲的认识，了解风味物质与微生物间的潜在联系，从而更好调控大曲的贮存和生产。本文在分析了酱香型大曲贮存初期差异微生物和差异风味的基础上，利用spearman 相关系数分析酱香型大曲贮存初期优势差异菌属间与特征风味物质间的互作关系，若相关系数大于0.6 且P＜0.05，则定义为具有显著相关性。如图4 可知，苯乙酸乙酯、丁酸乙酯、硬脂酸乙酯等酯类物质主要与细菌属存在关联性，如芽孢杆菌属（Bacillus）、海洋杆菌属（Oceanobacillus）、盐单胞菌属（Halomonas）等细菌属，除此之外，酯类物质还与真菌属、毕赤酵母属（Pichia）等酵母属存在强正相关性。前人研究发现酯类主要合成途径是醇和酸在酯化酶的作用下合成，都需要真菌和细菌在白酒发酵过程中参与完成的。芽孢杆菌属（Bacillus）、海洋杆菌属（Oceanobacillus）等细菌属与亚油酸、草莓酸、癸酸等酸类物质存在正相关性，与之前文献报道的相似。芽孢杆菌属（Bacillus）、海洋杆菌属（Oceanobacillus）与四甲基吡嗪、三甲基吡嗪等吡嗪类化合物存在正相关，与酱香型大曲高温制曲发生的美拉德反应有关系，也是酱香型高温大曲的标记性微生物和优势微生物。

图4 微生物和风味成分的相关性网络图

基于高通量测序技术和色谱分析技术探究了酱香型高温大曲在贮存初期微生物结构组成以及风味物质变化，并通过关联性分析解析了造成高温大曲在贮存过程中特征风味差异的内在原因。从微生物层面来看，贮存初期高温大曲的微生物群落结构在细菌和真菌上均存在显著差异。在细菌方面，海洋杆菌属（Oceanobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）等耐高温细菌属随着贮存时间的延长逐渐占据优势，与亚油酸、草莓酸、癸酸等酸类物质存在正相关；
毕赤酵母属（Pichia）等优势酵母属与酯类物质合成存在正相关性，主要是结合产酸细菌通过酯化反应生成大量的酯类物质，与微生物及风味的相关性分析结果相符合；
芽孢杆菌属（Bacillus）与四甲基吡嗪、三甲基吡嗪等吡嗪类物质存在正相关性，酱香型大曲总体氨基酸代谢程度在贮存初期时比较强烈，主要是酱香型高温大曲在制作和贮存过程中温度较高，使耐高温的微生物存活下来，并随着贮存时间的延长逐渐成为优势菌属，从而形成了酱香型大曲区别与其他香型大曲的独特风味。

本试验通过研究酱香型大曲在贮存初期主要优势微生物与典型风味物质的变化，通过关联性分析解释其潜在联系。本研究对酱香型大曲贮存初期的微生物变化进行了探讨分析，解析了微生物群落结构随着贮存时间的变化所带来的大曲风味成分的变化，对于企业在制作酱香型高温大曲时最佳贮存时间的确定提供了参考性建议和指导，受大曲样品取样及数量的局限性和风味检测的不稳定性等影响，还需要在大曲实际生产中进行追踪和确定；
对于利用大曲中主要功能微生物的强化提高酱香型中主要风味以及提升大曲的典型性提供了一定的理论基础，并对其进行功能微生物的筛选和功能验证对大曲进行强化，将其应用到实际的白酒酿造中。基于此研究期望能够在保证酱香型白酒特征风味的基础上，提高整体品质和质量。