倒置滤膜法测定水质中产气荚膜梭状芽孢杆菌

马 凯 邓 婕 左 嘉 刘 悦 王秋水 袁立艳 白文波 高丽娟*

(1.北京市科学技术研究院分析测试研究所（北京市理化分析测试中心）, 北京 100089；

2.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081)

产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens),又称魏氏梭菌(Clostridium welchii), 是一种革兰氏阳性杆状厌氧菌(G+), 广泛存在于空气、污水、土壤、各种食品以及动物和人类的胃肠道中[1]，是典型的毒素致病菌[2]，也是人类气性坏疽的主要病原菌，会导致食源性疾病、食物中毒、非食源性腹泻等疾病[3]。该细菌产芽孢，在极端条件下如高温高压、消毒剂、辐射等会产生抗逆性[4，5]，在处理污水时不易杀死，导致饮用水易受微生物污染，所以检测产气荚膜梭状芽孢杆菌是评价水资源污染程度的重要指标[6，7]。

目前国内外对于饮用水中产气荚膜梭状芽孢杆菌的检测指标还不够明晰。GB/T 5749−2006《生活饮用水卫生标准》中规定产气荚膜梭状芽孢杆菌（CFU/100 mL）的限制为0[8]，在GB/T 5750.12−2006《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》中并未规定其检验方法[9]。GB 8537−2018《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水》规定引用天然矿泉水中产气荚膜梭状芽孢杆菌（CFU/50 mL）的限量为n=5、c=0、m=0[10]。欧盟理事会98/83/EEC中采用滤膜法加厌氧培养法检测产气荚膜梭状芽孢杆菌[11]，ISO 6461−1:1986还原亚硫酸盐的厌氧菌（梭菌属）芽孢的检测和计数中采用液体培养基增菌法，6461−2:1986采用膜滤法，两部标准均是检测梭菌属（芽孢），不是针对产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验方法。英国国家标准EN 26461−1:1993和26461−2:1993是在前两者基础上的更新版本，非针对产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验方法。AOAC 976.30食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检测方法通过选择性培养基TSC分离和富集出典型菌落，然后挑取一定比例典型菌落进行确证试验，按比例计算出样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的数量[12,13]。美国标准AOAC 993.10贝类产品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的测定，通过MPN法与IMM法结合实现对样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的定量[14]，加拿大国家标准MFHPB⁃2、3[15]和日本《食品安全检测指南·微生物篇修订第2版2018》标准是通过选择性培养分离出产气荚膜梭状芽孢杆菌再进行计数。国内关于产气荚膜梭状芽孢杆菌检验标准方法主要有平板计数法、滤膜法和环介导恒温PCR的方法，PCR检测方法主要应用于临床检验中，此方法灵敏度高，特异性强，在临床上可以做出早期的快速诊断，为临床早期治疗提供依据。而传统的平板计数法和滤膜法分别用于食品或者水中的检测，相对成本较低，检测的准确性相对较高，适用于采用产气荚膜梭状芽孢杆菌作为指示菌来检测水中病原微生物[16]。

对现行有效的标准进行汇总对比以及常用检测产气荚膜梭状芽孢杆菌的方法发现，目前缺乏专门针对饮用水中产气荚膜梭状芽孢杆菌明确的检测方法和限量标准，且传统的检测方法存在耗时长、步骤复杂、所用培养基较多等缺点[17,18]。因此，本研究基于国家标准采用滤膜法，通过滤膜过滤一定体积水样，将菌截留在滤膜上，将滤膜培养在选择性培养基上，根据产生的典型菌落形态选取可疑菌落进行确证实验，并对该方法精密性、准确性进行了考察，以证明此方法具有普遍性、科学性、先进性和适用性。

1.1 仪器与试剂

SQP型电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司); BHC⁃1600 IIA/B3型生物安全柜(AIRTECH苏州安泰空气技术有限公司); AW200SG型厌氧培养工作站(英国依莱泰科公司); LRH⁃150型生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；
pH计；
冰箱；
恒温水浴锅；
显微镜；
微生物鉴定系统；
无菌滤器。

产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens,CICC 22949)、蛋白胨、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）、液体硫乙醇酸盐培养基( FT )、硫酸亚铁、新鲜全脂牛奶、卵黄琼脂培养基、革兰氏染色液、硝酸盐还原试剂、生化鉴定试剂盒，试剂均为北京陆桥。

1.2 实验方法

1.2.1 滤膜法

采用滤膜过滤器过滤水样，使水样通过孔径为 0.45 μm的滤膜过滤，细菌被阻留在膜上，将滤膜的截留面朝下贴在SPS培养基或TSC培养基上，36℃±1℃厌氧培养18~24 h后，计算黑色菌落数，挑选5个典型菌落进行确证试验，产气荚膜梭状芽孢杆菌是能够分解乳糖产酸产气，产卵磷脂酶分解卵黄中的卵磷脂，液化明胶的革兰氏阳性杆菌，结合确证试验结果与计数结果，计算得到100 mL样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌数[21]。

1.2.2 培养基中亚硫酸盐的浓度优化

潜在的产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落呈现黑色是判定可疑菌落的关键，是确证试验的基础。为使目标菌菌落呈现黑色，需将现行培养基中亚硫酸盐浓度提高1倍，即每100 mL基础培养基中添加100 mg亚硫酸盐。本研究中使用的SPS培养基中亚硫酸盐成分作为补剂单独保存，在使用时添加1支补剂。

1.2.3 滤膜放置的方式优化

在现行相关标准检测方法中，水样滤膜后滤膜的截留面朝上放置培养、或是滤膜的截留面朝上放置培养结合加注琼脂等[19,20]。滤膜的截留面朝下倒置培养，对比滤膜正置培养或加注琼脂法，产气荚膜梭状芽孢杆菌在在琼脂上呈现黑色效果更显著，选择性更强，容易辨别。

1.2.4 试验数据验证单位和试验用水的选择

从全国范围内选择5家检测机构作为试验数据验证单位进行试验的精密度、准确度验证。试验用实际水样来自覆盖全国范围的珠江、长江、黄河、淮河、辽河、海河、松花江等七大水系。

1.2.5 滤膜法的精密度实验

按照3种水样（末梢水自来水、水源水水库水和河水）分别接种低、中、高3个浓度的产气荚膜梭状芽孢杆菌制备样品，进行产气荚膜梭状芽孢杆菌滤膜法的检测，每种水样低、中、高浓度平行测定 6 次，分别计算样品的平均值、标准偏差、相对标准偏差[19，20]。

1.2.6 滤膜法的准确度验证

对产气荚膜梭状芽胞杆菌的标准样品（可接受范围为1000 CFU~5000 CFU）进行两次重复测定。对实际样品的测定，一共采集了110份水源水（河水、水库水）、末梢水（自来水）样品，其中38份自来水样品、36份水库水样品、36份河水样品[21]。

1.2.7 统计学数据分析

(1) 产气荚膜梭状芽孢杆菌的计数[22]：

对滤膜上确证为产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落进行计数。

(2) 产气荚膜梭状芽孢杆菌的计算：

根据检验用样品量，按下式计算出每100 mL样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落数，结果以CFU/100 mL计。

每100 mL样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌数（CFU/100 mL）=

式中：

A——可疑的黑色菌落数，CFU；

B——确证为产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落数，CFU；

C——用于确证试验的产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落数，CFU；

d——100 mL过滤水中实际包样品的量，100 mL。

2.1 培养基构成优化结果

SPS培养基中亚硫酸盐的作用是使产气荚膜梭状芽孢杆菌产生黑色菌落，产气荚膜梭状芽孢杆菌可还原亚硫酸盐为硫化物，硫化物与铁反应生成黑色硫化铁，使菌落中心呈黑色。本研究使用的SPS培养基中亚硫酸盐的浓度为每100 mL基础培养基中添加50 mg亚硫酸盐，通过标准菌株培养的实验，滤膜截留面朝上放置培养后的黑色菌落不明显，多数菌落呈现灰色或黄色（图1）。同样实验条件下，进一步将亚硫酸盐的浓度加倍，使得每100 mL基础培养基中添加100 mg亚硫酸盐，滤膜上菌落黑色程度改善不明显。

图1 滤膜截留面朝上培养，亚硫酸盐单倍浓度

在滤膜上方加注一层琼脂可以使产气荚膜梭状芽孢杆菌在琼脂上的菌落呈现黑色。但是加注琼脂会带来诸多不便，如注时会出现将滤膜上截留的菌冲起来的情况，被冲起来的产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落同样存在菌落黑色不明显或不显黑色；
加注一层琼脂后，会为后续接种针穿过琼脂挑取可疑菌落增加难度，如杂菌较多时，会出现挑取的菌落不纯的情况。

将滤膜的截留面朝下倒置，贴合培养基培养，可以缓解避免上述问题。并且与正置培养相比，菌落黑色程度增加，进一步将SPS培养基中亚硫酸盐的浓度加倍，使得每100 mL基础培养基中添加100 mg亚硫酸盐后，几乎滤膜上所有菌落都会呈现明显黑色，容易辨别。如图2所示。

图2 滤膜截留面朝下培养，亚硫酸盐加倍浓度

2.2 滤膜法的精密度实验结果

结果显示，各实验室低、中、高浓度相对标准偏差分别为4.1%~19.1%，3.1%~19.0%，3.1%~22.4%。具体见表1、表2、表3所示。

表2 加标的精密度测定结果（n=6）

表3 加标的精密度测定结果（n=6）

2.3 滤膜法的准确度实验结果

测定质控样品结果显示相对误差范围为−32.0%~110.0%；
相对误差最终值为22.8%±62.8%。110份实际样

品检测中检出样品21个，结果范围为0~180 CFU/100 mL。测定实际样品结果具体见表4和表5。

表4 质控样品的测定表

表5 实际样品的测定结果

通过改善SPS培养基成分构成，将培养基亚硫酸盐浓度提升为100 mg/每100 mL，结合将滤膜的截留面朝下倒置与培养基贴合培养，可以使产气荚膜梭状芽孢杆菌产生明显的黑色菌落，选择性更强，更便于菌落计数和进一步的确证试验的进行。

倒置滤膜法测定水质中产气荚膜梭状芽孢杆菌方法的建立，通过6家实验室，分析全国不同水系水样，得出该方法的精密度、准确度良好, 满足标准要求, 可用于实验室水质检验。整个实验过程不涉及特殊大型仪器设备，且检测成本低，实验操作技术难度不大，容易理解和掌握，适合全国各地不同发展技术水平实验室操作，具有科学合理性、适用性和普及性。