响应面法优化赤红球菌HDRR2Y发酵培养参数

张 淞， 胡晓娟， 徐 煜,3， 徐创文， 杨 铿， 苏浩昌， 徐武杰,3， 文国樑， 张建设， 曹煜成,3*

(1.浙江海洋大学 国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江 舟山 316022；
2.中国水产科学研究院 南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室/广东省渔业生态环境重点实验室，广东 广州 510300；
3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东 茂名 525000)

在集约化高密度养殖过程中，残料、粪便、养殖生物尸体、渔药等的积累易造成水体氨氮、亚硝酸盐等有害物质含量的升高，导致水质恶化[1-3]，从而对养殖生物产生胁迫或毒害，甚至致其死亡[4-5]。目前，常用去除养殖水体的氨氮、亚硝酸盐的方法包括物理法、化学法和生物法[6-7]。其中，生物法一般指利用微生物菌剂去除水体的有害氮素，这种方法具有成本低、无耐药性、无二次污染、易操作、效果好等优点，被广泛运用[8-10]。硝化菌因其能通过硝化作用将养殖水体中氨氮、亚硝酸盐转化为硝酸盐[11-12]，而成为去除水体有害氮素的微生物菌剂之一[13-14]。陈旭等[15]研究了硝化菌对养殖加州鲈鱼的池塘水质的影响发现，硝化菌能够显著降低池塘水体中亚硝酸盐的浓度、减缓水体总氮的上升，以及稳定水体pH。胡晓娟等[16]研究结果显示，硝化菌XH1对氨氮和亚硝酸盐均有显著的去除效果，对氨氮、亚硝酸盐的最高降解率分别达到97%、68%。Kuhn等[17]用市售硝化菌菌剂产品测定了养殖南美白对虾(Litopenaeusvannamei)水体中氨氮、亚硝酸盐的变化，结果发现添加了硝化菌菌剂产品的水体中氨氮、亚硝酸盐的含量显著低于对照组。红球菌(Rhodococcussp.)是湖泊、海洋等水体中常见的微生物，因其能有效降解多种化合物，常被应用于生物脱硫、工业污水处理等[18-19]。近年来，有研究发现了红球菌的硝化功能，具有应用于水产养殖业的前景。王淼等[20]研究结果显示，嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinovorans)P1-2对养殖罗非鱼水体中的氨氮去除率最高能达到94%以上。田雅洁等[21]报道了玫瑰红红球菌XH2不仅对各环境因子具有良好的适应性，还能显著降解水体中的氨氮浓度，证实了其硝化作用与活菌数呈正比。由此可见，细菌数量的提高是保证其硝化作用的前提。硝化菌的菌株特性和功能效果是前人关注的焦点，而由硝化菌菌株到菌剂产品的转化过程中，菌株生产工艺的优化是研发硝化菌菌剂产品的重要环节。曹煜成等[22]从对虾养殖尾水中筛选出一株硝化菌——赤红球菌(Rhodococcusruber)HDRR2Y，经证实该菌株环境适应性良好，在盐度10～40、温度20～40 ℃、pH 6～8条件下，该菌株对养殖水体中的无机氮具有显著的降解效果，其中对氨氮的最高降解率可达98.8%，有潜力成为硝化菌菌剂的备选菌株。本研究选择赤红球菌HDRR2Y作为研究对象，采用响应面分析法对其发酵培养参数进行优化，确定最佳发酵参数，拟提高赤红球菌HDRR2Y的活菌数，为硝化菌菌剂的工业化生产提供参考。

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 硝化菌——赤红球菌(Rhodococcusruber)HDRR2Y由中国水产科学研究院南海水产研究所提供，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC NO：M2019009)，并申请发明专利，申请号为202010159584.2。

1.1.2 培养基 发酵培养基(g/L)：C2H3NaO2·3(H2O) 3.0，酵母膏1.8，MgSO40.2，KH2PO40.5，CaCl20.5，NaCl 9.0，MnSO40.025，FeSO40.05，C5H9NO40.002。

1.1.3 主要仪器及设备 超净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司)；
三层全温振荡培养箱(ZQZY-88CV，上海知楚仪器有限公司)；
pH计(PHB-3，上海三信仪表厂)；
立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂)；
恒温培养箱(BPC-150F，上海一恒科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 单因素实验 分别用不同的碳源(葡萄糖、糖蜜、麸皮、可溶性淀粉、乙酸钠∶葡萄糖∶糖蜜=3∶1∶1，质量比)替换发酵培养基中的乙酸钠，其余成分相同，筛选出活菌数最高的碳源培养基。再分别用不同氮源(蛋白胨、氯化铵、豆粕、酵母膏∶蛋白胨∶氯化铵=1∶1∶1，质量比)替换碳源培养基中的酵母膏，其余成分相同，筛选出活菌数最高的氮源培养基。碳、氮源培养基初始接种量均为1%(体积分数)，30 ℃、200 r/min 培养36 h，各培养基的活菌数通过平板菌落计数法[23]计算。

1.2.2 Plackett-Burman实验 摇瓶培养中影响微生物生长的重要因素有温度、pH、转速、接种活菌数、装液量[24]，赤红球菌HDRR2Y来源于海水养殖尾水，盐度对菌株生长同样起重要作用，因此选定碳源、氮源、温度、pH、转速、盐度、接种活菌数、装液量8个因素进行Plackett-Burman实验设计。经实验证明[22]，赤红球菌HDRR2Y在温度20～30 ℃、pH 7～8、转速150～225 r/min、盐度15～30、接种活菌数(1×104)～(3×104) cfu/mL、装液量40%～60%的条件范围均有较好的生长，以此确定响应面实验中各因素的最低、最高水平。该实验在Design Expert 11软件中进行设计，赤红球菌HDRR2Y的活菌数为响应值，从碳、氮源等8个因素中筛选出显著影响活菌数的因素。

1.2.3 最陡爬坡实验 在Plackett-Burman实验的基础上进行最陡爬坡实验，最陡爬坡实验的变化方向及步长取决于显著因素的正负效应，确定最大值响应区域与水平，构建拟合方程。

1.2.4 Box-Behnken实验 在Design Expert 11软件中对Box-Behnken实验进行三因素三水平设计，试验由5个中心实验及12个析因实验组成，共17个组合，以此得出回归方程及理论最高活菌数。

1.2.5 摇瓶验证实验 采用摇瓶实验验证响应面分析实验得出的回归方程及理论最高活菌数的合理性。

1.2.6 数据统计分析 采用SPSS 20.0检验单因素实验组内各培养基活菌数的差异性。采用Design-Expert 11对Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验以及Box-Behnken实验进行设计与分析。

2.1 单因素实验

通过单因素实验，测试了不同碳源、氮源对赤红球菌HDRR2Y的影响。由图1a可知，乙酸钠组(So)活菌数最高，培养36 h后的活菌数为1.8×108cfu/mL，显著高于另外5组(P<0.05)，因此，选择乙酸钠作为发酵培养基的碳源。以酵母膏+蛋白胨+氯化铵组(Y+Pe+A)做氮源，培养36 h时活菌数最高，可达3.37×108cfu/mL，显著高于另外3组(P<0.05)(图1b)。因此，选择酵母膏∶蛋白胨∶氯化铵=1∶1∶1(质量比)作为发酵培养基的氮源进行后续试验。

图1 不同碳源(a)、氮源(b)对赤红球菌HDRR2Y活菌数的影响Fig.1 Effect of different carbon sources (a) and nitrogen sources (b) on the amount of Rhodococcus ruber HDRR2YB:麸皮；
St:可溶性淀粉；
So:乙酸钠；
G:葡萄糖；
M:糖蜜；
So+G+M:乙酸钠+葡萄糖+糖蜜；
Y+Pe+A:酵母膏+蛋白胨+氯化铵；
Sm:豆粕；
Y:酵母膏；
Pe:蛋白胨。字母相同与不同分别表示差异显著(P<0.05)与不显著(P>0.05)B: bran; St: starch; So: sodium acetate; G: glucose; M: molasses; So+G+M: sodium acetate+glucose+molasses;Y+Pe+A: yeast extract+peptone+ammonium chloride; Sm: soybean meal; Y: yeast; Pe: peptone. The same letters and different letters in figure 1 indicate significant differences (P<0.05) and insignificant differences(P>0.05), respectively

2.2 响应面分析实验结果

2.2.1 Plackett-Burman实验结果 8个影响因素对赤红球菌HDRR2Y活菌数的影响顺序为乙酸钠>温度>(酵母膏+蛋白胨+氯化铵)>接种活菌数>pH>装液量>转速>盐度。其中，乙酸钠、温度、酵母膏+蛋白胨+氯化铵对赤红球菌HDRR2Y的活菌数影响显著(P<0.05)，其他5个因素对赤红球菌HDRR2Y的活菌数影响不显著(P>0.05)(表1)。因此，选择乙酸钠、温度、酵母膏+蛋白胨+氯化铵三个因素进行下一步实验。

表1 Plackett-Burman实验设计与多元回归分析

2.2.2 最陡爬坡实验结果 赤红球菌HDRR2Y的活菌数随乙酸钠、酵母膏+蛋白胨+氯化铵、温度逐步增加呈现出先升高后下降的趋势，当乙酸钠质量浓度6 g/L, 酵母膏+蛋白胨+氯化铵质量浓度4.6 g/L，温度30 ℃时，活菌数达到最大值，以此为基础进行Box-Behnken实验(表2)。

表2 最陡爬坡实验设计与结果

2.2.3 Box-Behnken实验结果 Box-Behnken实验的设计及结果见表3、表4，以此为基础进行回归分析，得到关于乙酸钠(A)、酵母膏+蛋白胨+氯化铵(B)和温度(C)的二次回归方程:Y=16.02-0.66A+0.80B-0.50C+0.60AB+1.56AC-0.26BC-2.42A2-2.08B2-2.15C2，表5显示回归模型达到了极显著水平(P<0.001)，说明该模型可信度高。判定系数R2为0.983 8(R2>0.9)，失拟项为0.497 7(P>0.05)，进一步说明模型拟合且可靠。实验变量乙酸钠(A)、酵母膏+蛋白胨+氯化铵(B)、温度(C)的一次项和二次项均对赤红球菌HDRR2Y的活菌数影响显著，乙酸钠(A)与酵母膏+蛋白胨+氯化铵(B)的交互作用对赤红球菌HDRR2Y的活菌数影响显著，乙酸钠(A)和温度(C) 的交互作用对赤红球菌HDRR2Y的活菌数影响同样显著，说明三个变量间有比较大的交互作用。Box-Behnken实验的曲面图的曲面开口向上与向下分别代表响应值存在极大值与极小值；
等高线图的等高线呈椭圆形与圆形分别表示各因素间的交互作用对响应值影响显著与不显著[25]。乙酸钠用量与酵母膏+蛋白胨+氯化铵用量对赤红球菌HDRR2Y活菌数的影响见图2，曲面开口向下且曲线陡峭、等高线椭圆形表明乙酸钠用量与酵母膏+蛋白胨+氯化铵用量的交互效应显著。乙酸钠用量与温度对赤红球菌HDRR2Y活菌数的影响见图3，曲面开口向下且曲线陡峭、等高线椭圆形表明乙酸钠用量与温度的交互效应显著。酵母膏+蛋白胨+氯化铵用量与温度对赤红球菌HDRR2Y活菌数的影响见图4，等高线圆形表明酵母膏+蛋白胨+氯化铵用量与温度的交互效应不显著，说明赤红球菌HDRR2Y摄取酵母膏+蛋白胨+氯化铵中的营养物质受温度影响较小。

表3 Box-Behnken实验因素及与水平设计

表4 Box-Behnken设计及结果

表5 回归分析结果

2.3 摇瓶验证实验

经过回归分析，最终得出赤红球菌HDRR2Y的最佳发酵培养参数分别为乙酸钠5.48 g/L、酵母膏+蛋白胨+氯化铵4.96 g/L、温度29.24 ℃、pH 7.0、转速200 r/min、MgSO40.2 g/L、KH2PO40.5 g/L、NaCl 9 g/L、CaCl20.5 g/L、MnSO40.025 g/L、FeSO40.05 g/L、C5H9NO40.002 g/L、装液量40%(体积分数)、接种活菌数1×104cfu/mL、培养时间36 h。在该条件下，通过回归分析得出的理论活菌数为1.62×109cfu/mL，通过摇瓶验证实验得到的实际活菌数为1.54×109cfu/mL，两者之间无显著性差异(P>0.05)，但远高于未经响应面优化前的活菌数(1.8×108cfu/mL)(P<0.01)。

图2 乙酸钠和酵母膏+蛋白胨+氯化铵对赤红球菌HDRR2Y活菌数作用的响应面分析曲面和等高线图Fig.2 Response surface analysis surface plot and contour plot of the effect of sodium acetate and yeast extract+peptone+ammonium chloride on the amount of Rhodococcus ruber HDRR2Y

图3 乙酸钠和温度对赤红球菌HDRR2Y活菌数作用的响应面分析曲面和等高线图Fig.3 Response surface analysis surface plot and contour plot of the effect of sodium acetate and temperature on the amount of Rhodococcus ruber HDRR2Y

图4 酵母膏+蛋白胨+氯化铵和温度对赤红球菌HDRR2Y活菌数作用的响应面分析曲面和等高线图Fig.4 Response surface analysis surface plot and contour plot of the effect of yeast extract+peptone+ammonium chloride and temperature on the amount of Rhodococcus ruber HDRR2Y

响应面分析法是应用广泛的微生物发酵培养参数优化方法之一，可显著提高微生物活菌数。Mazzucotelli等[26]通过响应面分析法优化了苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)的发酵培养参数，提高了其产量；
马乐等[27]采用响应面法对蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)Km121的发酵培养基进行了优化，活菌数提高了35.2%；
孙文等[28]通过单因素实验与响应面分析实验将短短芽胞杆菌(Brevibacillusbrevis)ch2-22的芽胞量提高了3.7倍。本研究通过响应面分析法优化获得赤红球菌HDRR2Y的最优培养基配方，培养36 h活菌数由1.8×108cfu/mL显著提高到1.54×109cfu/mL。

碳源是微生物进行生命活动所需能量的来源，也是构成微生物细胞及其代谢产物的碳素来源[29]。氮源是微生物细胞中酶、核酸、蛋白质等以及微生物代谢产物的氮素来源[30]。微生物对各种碳源及氮源需求广泛，其新陈代谢能力与碳、氮源的种类关联很大，因此，选择合适的碳、氮源能有效提高其活菌数[31]。本研究从赤红球菌的生理生化特性出发，通过单因素实验筛选得到了更利于赤红球菌HDRR2Y生长的碳源(乙酸钠)及氮源(酵母膏+蛋白胨+氯化铵)。乙酸钠是常用的碳源，属于小分子有机物，易于被微生物利用，且便宜易得[32]。因此使用乙酸钠作为碳源可以缩短赤红球菌生长的时间。酵母膏、蛋白胨是常用的有机氮源，酵母膏同时含有有机氮化合物和碳水化合物，为微生物提供碳、氮源以及生长因子等[33]；
蛋白胨是将明胶、肉、酪素等水解浓缩、干燥后制作而成的粉末，富含各类氨基酸及多肽等营养物质，能够促进细胞生长[34]；
氯化铵是常用的无机氮源，为大宗商品，价格低廉，适合工业化生产[35]。研究表明，有机氮源与无机氮源同时使用比单独使用更有利于微生物的生长[36]。本研究以酵母膏+蛋白胨+氯化铵组合为氮源的活菌数显著高于单种氮源组的活菌数，两者结论相符。由最陡爬坡实验可知，温度也是影响微生物活菌数的显著因素，温度会影响代谢反应的结果，同时会影响微生物的生理活动[37]。田雅洁等[21]研究显示玫瑰红红球菌XH2在30 ℃时活菌数达到最高，同时对水体氨氮降解率达到100%；
本研究中最适温度为29.24 ℃，与田雅洁等[21]的研究结果基本一致。

本研究对赤红球菌HDRR2Y培养基碳、氮源和培养温度进行了响应面分析，最终得到菌株最优发酵培养参数。经优化后，赤红球菌HDRR2Y发酵36 h的活菌数达到1.54×109cfu/mL，比优化前活菌数提高了近10倍，为硝化菌菌剂的工业化生产提供相关数据参考。