光质对桔梗叶花青素含量及酶活性的影响

吴珍

（商洛学院生物医药与食品工程学院/商洛市秦岭植物良种繁育中心，陕西商洛 726000）

桔梗[Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.]为桔梗科多年生的药用、食用、观赏多用植物[1]，桔梗中含皂苷、黄酮、桔梗多糖等多种化学成分，具有抗肿瘤、抗氧化等效用[2]，其花中富含花青素多呈蓝、紫等色，花青素具有降低血清及肝脏中脂肪含量、抗肿瘤及抗氧化等作用[3]。花青素是植物的次生代谢产物，植物花色的强弱取决于花青素的合成和积累量[4]，花青素合成以苯丙氨酸为起点经三个阶段，最终生成稳定的花青苷[5]。其中第一阶段（苯丙烷途径）的关键酶有PAL（苯丙氨酸转移酶）、C4H（肉桂酸-4-羟化酶）等，花青素合成的直接前体是第一阶段的产物；
第二阶段是由CHS（查尔酮合成酶）、F3H（黄烷酮 3-羟化酶）等酶催化的类黄酮的合成；
第三阶段即由DFR（二氢黄酮醇还原酶）、ANS（花青素合成酶）等关键酶催化的花青素的合成及修饰途径[6]，此阶段形成稳定的花青素，因而花颜色的形成与PAL、CHS、F3H、DFR、ANS 等一系列关键酶有关，DFR、ANS基因的表达量与花青素积累及花色强度密切相关。植物生长物质、光、温度、水分胁迫、糖、氮和磷及金属离子等植物生长中的生物和非生物因子都调控花青素的合成，光也是诸多影响花青素等次生代谢产物的种类和含量的重要环境因子之一[7-8]，光质、光强度及光照时间均能影响花青素的合成，而光质起着关键作用[9]，光质能诱导酶活性改变，从而调控次生代谢产物的分配，进而影响植物活性成分的含量[10]。在绿色组织及组织培养的细胞中，光主要通过激活花青素代谢途径中相关基因的表达来合成并积累花青素，对合成花青素最有效的蓝光和紫外光可以增强相关基因的表达，提高酶活性，促进植物呈色[11]。目前关于花青素合成积累调控的研究多集中于果蔬和观赏植物类，关于药用植物花青素合成积累与环境因子的相关性方面的研究少见报道。本文探讨不同光学滤膜处理的桔梗叶中花青素相对含量与DFR、ANS活性变化的相关性，为进一步研究桔梗有效成分的积累和花色的形成提供理论依据。

1.1 材料

采用商洛学院秦岭植物良种繁育中心的一年生桔梗苗，定植于直径30 cm、高度40 cm的花盆中，用田园土与肥料混匀成盆土。每盆种3株。桔梗植株长至12～16片叶时，将5面用滤膜覆盖的钢架置于花盆上方进行处理，支高盆底以通风，其它管理正常。处理后每7 d采样1次，共采样3次，测定叶中花青素含量和DFR、ANS活性，所有处理均重复3次。

1.2 方法

1.2.1 花青素含量测定

取0.3 g新鲜叶片置于1 mL 1%HCl-甲醇（1%HCl，m/v）中，在室温下震荡（50 r/min）18 h后，取样品于14 000 r/min离心，沉淀1 min后，取0.4 mL上清液加到0.6 mL的1%HCl-甲醇溶液中，于530 nm和657 nm下测定提取液的吸光值，以1%HCl-甲醇溶液为空白对照，以ΔA=(A530nm－0.25×A657nm)/g 表示花青素含量[12]。

1.2.2 DFR活性测定

酶液提取：叶片剪碎称取0.2 g加预冷的提取液［0.1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5），0.01 mol/L抗坏血酸，5mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），0.1% β-巯基乙醇，0.01 mol/L对氨基苯基甲磺酰（APMSF）］6 mL，冰浴研磨，12 000 r/min低温离心20 min，沉淀用提取液重复提取，上清液为DER粗酶液[13]，低温保存。

酶活性测定：配1.1 mL反应混合液（0.1 mol/L Tris buffer pH 7.4，1 μmol/L 二氢槲皮素（DHQ），1 μmol/L NADPH，0.3 mL粗酶液），30 ℃水浴1 h后加1 mL乙酸乙酯，用旋转蒸发仪蒸发（40℃），重复3次，合并提取液用0.2 mL蒸馏水提取3次后加1 mL丁醇-盐酸（95:5，V/V）于提取物中，95℃热水浴 30 min使酶失活，测550 nm吸光度，以每分钟吸光值变化0.01所需的酶量为1个酶活性单位，即1 U，计算DFR 活 力[14]：DFR 活 力 =(ΔA550nm×1.8 ×2)/(0.01×0.6×mFW)。

1.2.3 ANS活性测定

酶液提取及测定参照杜丽娟[15]的方法，称取桔梗叶片1.0 g放入研钵中，加5 mL预冷的提取液[0.1 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），40 mmol/L蔗糖，0.75 mmol/L聚乙二醇 20 000，0.1 mol/L抗坏血酸钠，1.0 mmol/L DTT，25 umol/L 氯化钙，pH 7.3]，冰浴研磨，滤液于10 000 r/min低温离心30 min，上清液即粗酶液，低温保存。

酶活性测定：取粗酶液350 μL于试管中，依次加入 40 mmol/L PBS（pH 7.0）1.5 mL，1.0 mol/L氯 化 钠 600 μL，0.1mol/L 麦 芽 糖 300 μL，0.1mol/L DTT 150 μL，80 mmol/L 抗坏血酸钠150 μL，40 mmol/L α-酮戊二酸 75μL，16 mmol/L FeSO475 μL， 加入 1.0 mmol/L DHQ 50 μL 开始反应，30℃下水浴2 min。340 nm监测2 min内的二轻槲皮素转换为槲皮素的吸光度变化来测定ANS活性。在30℃，以每毫克蛋白1 min DHQ催化底物生成产物槲皮素的吸光度变化为1个ANS单位。每处理花青素含量及活性测定均重复3次。

1.2.4 数据分析

所得数据用Graphpad prism 5及SPSS17.0进行显著性和相关性分析，并建立不同处理桔梗叶中花青素含量与DFR、ANS活性的回归模型。

2.1 光质对桔梗叶中花青素含量的影响

由图1可看出，与日光下的对照组（CK）相比，在处理7，14，21 d时，蓝膜下桔梗叶中花青素含量显著高于 CK（P<0.05），紫膜下在 7，14 d时花青素含量显著高于CK（P<0.05），21 d时花青素含量虽高于CK但不显著；
蓝色和紫膜处理下花青素含量均呈现先增加后下降的总趋势（P<0.05）。红膜处理7 d时花青素含量显著高于CK（P<0.05），14 d时虽高于CK但不显著，21 d时显著低于CK（P<0.05），红膜处理花青素含量虽呈现先增加后下降趋势但未达显著水平。在处理7，14，21 d时黄膜及绿膜下桔梗叶中花青素含量均显著低于对照（P<0.05），均呈现逐渐下降的趋势但未达显著水平。在3次测定中桔梗叶中花青素含量高低次序均为蓝膜>紫膜>红膜>CK>黄膜>绿膜。

图1 不同光质对桔梗叶中花青素含量的影响

2.2 光质对桔梗叶中DFR活性的影响

由图2可以看出，与CK相比，在处理7，14，21 d时，蓝、紫和红膜处理下桔梗叶中DFR活性均显著增强CK（P<0.05），黄、绿膜处理下DFR活性虽均高于CK但只在14 d时达显著水平（P<0.05）。7 d时DFR活性由高到低依次为蓝膜>紫膜>红膜>黄膜>绿膜>CK；
14 d和21 d时DFR活性由高到低依次为蓝膜>紫膜>红膜>绿膜>黄膜>CK；
各组桔梗叶中DFR活性均出现先上升后下降的趋势但均未达显著水平。

图2 不同光质对桔梗叶中DFR活性的影响

2.3 光质对桔梗叶中ANS活性的影响

由图3可以看出，在处理7 d时各处理组桔梗叶片中ANS活性均显著高于CK（P<0.05），ANS活性依次为蓝膜>紫膜>黄膜>绿膜>红膜>CK；
14 d时蓝、紫膜处理下ANS活性仍显著高于CK（P<0.05），黄、绿、红膜处理组 ANS活性虽均高于CK但也都不显著，各处理下ANS活性依次为蓝膜>紫膜>红膜>黄膜>绿膜>CK；
在处理21 d时，各处理桔梗叶中ANS活性均比14 d急剧下降且低于各处理在7 d的ANS活性，黄膜、绿膜处理下ANS活性均低于CK，但均不显著；
蓝、紫、红膜处理下的ANS活性仍高于CK，且紫、红膜处理组达显著水平（P<0.05）；
各处理下 ANS活性依次为紫膜>红膜>蓝膜>CK>绿膜>黄膜。3次测定中，蓝、紫膜处理桔梗叶中ANS活性均出现先上升后下降的趋势，而绿膜组ANS活性在7 d达到高峰后就开始持续显著下降（P<0.05），黄膜、红膜处理组也呈现相同下降趋势但未达显著水平。

图3 不同光质对桔梗叶中ANS活性的影响

2.4 花青素含量与DFR、ANS活性的相关性分析

由表1可知，各处理桔梗叶中花青素含量与DFR活性均显著相关（P<0.05），除第7 d绿膜处理组外其余各处理都达到极显著水平（P<0.01）；
除第7，14 d黄膜处理和第21 d绿膜处理外，其余各处理桔梗叶中花青素含量与ANS活性均呈现显著相关（P<0.05）。采用线性回归法建立的回归模型（表2）可进一步验证蓝、紫、红膜处理及CK桔梗叶中花青素含量与DFR、ANS活性均呈显著线性关系（P<0.05），可初步认定DFR、ANS均为影响桔梗花青素合成的关键酶。由表3中多元回归分析结果可得出桔梗 叶中花青素含量关于DFR、ANS活性的总回归方程y=0.242x1+0.261x2-9.148，方差分析结果F为 368.695（P<0.000 1），该回归方程多元决定系数R2为0.935、直接通径系数即表 3 中标准系数 0.396，0.598（P<0.001），表明DFR、ANS活性与花青素含量都呈显著的线性关系，误差对因变量的剩余通径系数，说明尚有剩余影响因素未被考虑，有待进一步研究。

表1 桔梗叶中花青素含量与DFR、ANS活性的相关性

表2 桔梗叶中DFR、ANS活性对花青素含量影响的线性回归模型

表3 桔梗叶中DFR和ANS活性对花青素含量影响的多元回归分析

植物的叶片在光信号转导及光控发育过程中起着重要作用，叶中含有光敏素等光受体，是感受光周期的主要器官，可将信号传递到花组织中，激活花青素的合成通路，从而使花器官呈色，同时叶作为主要光合器官提供了合成原料和酶、转录因子等，因而直接影响花器官的生长发育及花青素的合成速度和含量。

本研究发现，蓝、紫色滤膜处理下的光能显著提高桔梗叶中的花青素含量和DFR、ANS活性，花青素含量与DFR、ANS活性的动态变化规律呈现一致性，均呈现先上升后下降的趋势，说明蓝、紫两种色光能提高花青素合成途径中的关键酶的活性，从而促进了花青素合成与积累，花青素含量与DFR、ANS活性的线性回归模型[16]也验证了这一结论，说明DFR、ANS均为花青素合成途径的关键酶。本研究通过分析结果则说明不仅DFR、ANS能引起花青素含量的变化，而且代谢通路中的各种酶都有可能引起花青素含量的变化，植物花青素也具有多条合成途径并受多种酶的调控，同种酶在不同植物的花色苷合成途径中的作用不尽相同[17-18]；
ANS活性的直接通径系数（0.598）大于DFR活性的直接通径系数（0.396），说明ANS活性对花青素含量的直接影响大于DFR的影响，这有可能是因为在花青素合成第三阶段中ANS（花青素合成酶）位于DFR（二氢黄酮醇还原酶）等关键酶的下游，其距离最终产物的合成更近，通过对花青素的合成及修饰途径影响花青素含量；
剩余通径系数为0.254，说明有多种酶[19]（各个路径的各种关键酶）与DFR、ANS共同调控花青素的合成，有关光质对桔梗叶和花中花青素合成途径中其他几种关键酶活性的影响也需进一步进行研究。

本研究中蓝、紫膜处理21 d时花青素含量虽仍显著高于对照，但是已呈现下降趋势，可能是由于试验中所用光学滤膜的颜色、厚度及透光率造成光通过滤膜后的光强度有所下降，所以处理时间较长后因光强度不足影响植株的光合等初生代谢因而影响次生代谢导致试验产生误差，因而还需进一步研究。

此外本研究只探讨了光质对桔梗花青素合成代谢途径的影响，而光强度及光照时间对桔梗花青素合成及酶活性的研究也有待于继续进行，需进一步利用多种环境因子进行科学试验才能更合理地解释光对桔梗绿色组织花青素合成及花色的形成的影响，为桔梗的良种选育、栽培及药、食、赏等品质的提高建立基础。