基于数据挖掘与药效筛选的中医药干预抗结核药物所致肝损伤核心方药研究

施铮,王璐瑶,韦英杰,汪晶,鲁晏武,潘扬,余黎,虞舜

(1.南京中医药大学中医药文献研究所,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学针灸推拿学院·养生康复学院,江苏 南京 210023;3.江苏省中医药研究院,江苏 南京 210028;4.宁波市中医院皮肤科,浙江 宁波 315010;5.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023)

结核病至今仍是严重的公共卫生问题[1]。抗结核化学疗法是干预结核病的有效手段,但多数一线化疗药物都有潜在肝毒性,易产生抗结核药物肝损伤(Antituberculosis drug-induced liver injury,ATDILI)[2],最终导致化疗中断,甚则治疗失败。中医药疗法干预ATDILI具有明显优势,自20世纪90年代以来,临床报道多,但治法各异,令人莫衷一是,急需运用新方法、新思路进行系统整理与挖掘[3]。本文拟将数据挖掘与药理实验验证相结合,分析中医药干预ATDILI的用药规律,筛选核心方药。

1.1 资料与方法

1.1.1 处方来源 搜索中国知网、万方、中国生物医学文献数据库(CBM)、读秀、维普、PubMed、Web of Science等数据库,收集中医药干预ATDILI的临床报道、学术专著。检索时限均从建库至2020年6月15日。由2名研究者独立筛选文献、评价方法学质量,提取数据,并交叉核对,若遇分歧,则讨论或咨询第3名研究者判定,缺乏的信息尽量与作者联系予以补全。检索式与检索流程见图1。共筛选出118篇文献，其中一些报道对不同证型采用不同方剂辨证施治，共342首中医药干预ATDILI的方剂。

1.1.2 数据整理与录入 将342首方剂,参照《中华人民共和国药典》对药名进行统一标准化处理,冷背异名如“南岭荛花”,则参考《中华本草》转化为“了哥王”,系统整理清洗后录入,统一药物的别名、异名,完成录入后,再交专人校对。

1.1.3 数据分析 方剂数据挖掘运用中医传承辅助平台(V2.5),对用药频次进行描述性统计;基于关联规则挖掘本研究的药物配伍规律。

1.2 结果

1.2.1 用药频次 342首处方,涉及药物229种,总频次3 835次,按降序排列,可得到频次在25以上的药物41味,见表1。

表1 高频药物Table 1 High frequency drugs

1.2.2 关联规则 设置支持度个数为88,置信度为0.8,将药对降序排序,得到频次≥88的药对,共有17条,涉及中药11味,见表2。共得到关联规则11条,见表3,网络图展示见图2。设置支持度个数为122,置信度为0.8,降序排列,得到频次≥122的药对,共有4条,涉及中药5味,网络图展示见图3。将图3获得的高频、高置信度的5味中药组合视为本研究的核心方，与频次最高的前8味单药，纳入下一步药效筛选研究。

表2 支持度个数88条件下药对组合Table 2 Drug pairs in the support degree number of 88

表3 常用药物规则分析Table 3 Analysis of common drug rules

图2 支持度个数为88时药物关联的网络图Fig.2 Network diagram of drug associations in the support degree number of 88

图3 支持度个数为122时药物关联的网络图Fig.3 Network diagram of drug associations in the support degree number of 122

2.1 材料与方法

2.1.1 仪器 体式显微镜(SMZ-800N,日本NIKON公司);荧光显微镜(Leica DMI 3000B,德国Leica公司);分析天平(MT5,瑞士METTLER TOLEDO公司);生化培养箱(SPX-80,宁波海曙赛褔实验仪器厂);氮吹仪(N-EVAP-11,美国Organomation公司)。

2.1.2 药品与试剂 异烟肼(INH,美国Sigma-Aldrich公司,批号:MKCJ5583);甘草酸二铵注射液(DG,10 mL∶50 mg,正大天晴药业股份有限公司,批号:191219104);醋柴胡(BupleurumchinenseDC.,安徽省金芙蓉中药饮片公司,批号:02-19060101)、茯苓[Poriacocos(Schw.) Wolf.,安徽存真中药饮片有限公司,批号:200301]、炒白芍(PaeonialactifloraPall.,安徽省金芙蓉中药饮片公司,批号:01-19080101)、茵陈(ArtemisiacapillarisThunb.,安徽嘉佑中药饮片有限公司,批号:20200401)、炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.,江苏华洪药业科技有限公司,批号:200526)、丹参(SalviamiltiorrhizaBge.,安徽存真中药饮片有限公司,批号:200602)、郁金(CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling,安徽存真中药饮片有限公司,批号:200301)、炒白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.,安徽存真中药饮片有限公司,批号:191102),均购买于南京南中医大国医堂门诊部,经南京中医药大学陈建伟教授鉴定。斑马鱼胚胎培养基:5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.33 mmol·L-1CaCl2、0.33 mmol·L-1MgSO4。

2.1.3 实验动物 Tuebingen品系斑马鱼、CZ320[ihb175Tg,Tg(-1.7apoa2:GFP)]品系肝脏特异性荧光标记斑马鱼,均为4～6月龄,购买于南京尧顺禹生物科技有限公司。

2.1.4 核心方药提取物的制备 取核心方药:高频药物8种(柴胡、茯苓、白芍、茵陈、炙甘草、丹参、郁金、白术)、核心方1种(柴胡、茯苓、白芍、炙甘草、茵陈，1∶1∶1∶1∶1)各20 g,分别第1次加入10倍体积纯净水煎煮1 h,将液体过滤后倒出,第2次加入10倍体积纯净水煎煮1 h,将液体过滤后倒出。合并2次滤液,加纯水至400 mL(合生药量50 mg·mL-1),取20 mg生药量药液吹干备用,临用前用培养基适当稀释,分别配制不同浓度的供试液。

2.1.5 斑马鱼幼鱼的收集处理方法 斑马鱼的养殖参照Zebrafish Book[4]。Tuebingen品系斑马鱼雌雄分开饲养,定时喂以孵化的丰年虾卵,饲养条件按照光照14 h/黑暗10 h,水温28 ℃的循环水系统。于收集鱼卵前1日16:00按雌雄比1∶1挑选健康性成熟的斑马鱼放入产卵缸中,次日9:00—10:00收集受精卵。将受精卵挑选、清洗后移入胚胎培养用水中培养,并滴入亚甲基蓝消毒。在受精卵发育至72 hpf,得到3 dpf幼鱼,挑选发育正常的幼鱼,移入24孔板中,每孔8尾,同一浓度设3个重复孔。将3 dpf幼鱼暴露在不同浓度的供试液中,每孔2 mL溶液。连续给药3 d,每天换液。实验重复3次。CZ320品系斑马鱼复筛,每孔3尾幼鱼,设3个重复孔,其余与Tuebingen品系相同。

2.1.6 核心方药干预斑马鱼ATDILI模型的药效观察 设置空白对照组(胚胎培养基)、模型组(INH 8 mmol·L-1)、阳性药物组(INH与DG4、20、100、500 μg·mL-1联合给药)以及INH与待筛选核心方药(高频药物8种,核心方1种,见“2.1.4”)水提液50、100、200、400、800 μg·mL-1联合给药组,共51组,每组72尾幼鱼,在给药72 hpe记录Tuebingen斑马鱼死亡数和畸形数,计算死亡率和畸形率。在体视显微镜下观察斑马鱼的形态变化情况。选用死亡率最低，且死亡率相同时畸形率最低的浓度组，使用CZ320品系斑马鱼验证初筛结果,每组27尾幼鱼,在荧光显微镜下观察肝脏形态变化情况。

2.1.7 数据分析 使用SPSS22.0统计软件。计数资料采用卡方检验;计量资料在满足正态分布和方差齐性的前提条件下,进行组间方差分析,组间比较采用Tukey"s检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.2 结果

2.2.1 核心方药对斑马鱼幼鱼ATDILI模型死亡率、畸形率的影响 与空白对照组相比,ATDILI模型组的死亡率、畸形率均显著上升(P<0.01);与模型组相比,随着给药浓度的增加,待筛选药物死亡率、畸形率均显著下降(P<0.05，P<0.01),至高浓度时(400～800 μg·mL-1)，死亡率、畸形率又有所上升，见表4～5。

表4 核心方药对斑马鱼ATDILI模型死亡率的影响Table 4 Effects of core prescriptions and drugs on mortality in zebrafish ATDILI models

表5 核心方药对斑马鱼ATDILI模型畸形率的影响Table 5 Effect of core prescriptions and drugs on malformation rate in zebrafish ATDILI models

(续表)

2.2.2 核心方药对斑马鱼幼鱼形态学变化的影响 与空白对照组相比,模型组出现鱼鳔缺失或减小、卵黄囊吸收延滞、脊柱弯曲、心包水肿;与模型组相比,随着给药浓度增加(100～200 μg·mL-1),多数待筛选药物组形态学变化均有不同程度改善,至高浓度时(400～800 μg·mL-1)恶化。见图4。

注：Control.空白对照组；
INH.INH 8 mmol·L-1;DG和中药水提物浓度单位为μg·mL-1；
黑色箭头指示心包水肿;红色箭头指示鱼鳔缺失或减小;黄色箭头指示卵黄囊吸收延滞;蓝色箭头指示脊柱弯曲。图4 斑马鱼幼鱼形态图Fig.4 Morphological diagram of zebrafish larval

2.2.3 核心方药对CZ320品系斑马鱼ATDILI模型的影响 与空白对照组相比,模型组的斑马鱼肝脏荧光面积显著下降,荧光光密度显著降低(P<0.01)。与模型组相比,待筛选药物组的斑马鱼肝脏荧光面积显著上升,荧光光密度显著增强(P<0.01)。见图5。

注：Control.空白对照组；
INH.INH 8 mmol·L-1图5 72 hpe斑马鱼幼鱼的肝脏荧光情况比较Fig.5 Comparison of liver fluorescence of 72 hpe juvenile zebrafish

3.1 用药分类

根据用药频次统计，本研究中补虚药(共1 115次,29.07%)、清热药(共634次,16.53%)、利水渗湿药(共524次,13.66%)位居前3位,单味药以柴胡频次最高,体现了补虚、清热、利湿是治疗ATDILI的最常用治法。余下排序为活血化瘀药、疏肝药、理气药、化痰止咳平喘药等。①补虚药:ATDILI多因禀赋虚弱,感染痨虫在先,加之化疗疗程长,药毒侵袭,损伤肝脾,久病入肾,以致脾肺气虚、肝肾阴虚,故以补气药(共564次,14.71%)补脾肺之气,扶正祛邪；
以补血药(共321次,8.37%)补血养血以柔肝敛阴；
以补阴药(共215次,5.61%)补养因痨虫受损之肺阴、因药毒受损之胃阴及肝肾之阴。②清热药:清热药占第2位,化疗药物药毒侵肝,络脉瘀阻,气火失调,以致湿热内生,瘀血内阻,以药毒、湿热、气滞、血瘀为标,故以清热凉血药(共221次,5.76%)清热凉血,活血散瘀,除肝经瘀热;以清热解毒药(共169次,4.41%)清热解毒兼利湿;以清热燥湿药(共130次,3.39%)清热燥湿,泻肝火,解肝毒。③利水渗湿药:以利湿退黄药(共267次,6.96%)最多,入肝胆经,清利湿热,利胆退黄,使湿热得清,黄疸得除;以利水退肿药(共238次,6.21%)利水渗湿,健脾泻热。

3.2 常用药对分析

常用药对降序排列,柴胡为核心,见表2。①柴胡-白芍频次最高,其源于《伤寒论》之四逆散,肝为刚脏,体阴用阳,柴胡疏肝解郁、白芍柔肝养血,二者并用,为调肝的基本药对。②柴胡-茯苓排第2位,其源于《圣济总录》之柴胡茯苓汤,为疏肝健脾之常用药对。药毒伤肝,肝病传脾的病机特点在本研究中十分突出,柴胡-茯苓即为此而设。③柴胡-炙甘草排第3位,其源于《伤寒论》之小柴胡汤,柴胡疏肝,甘草缓肝急、解肝毒、补脾气,该药对疏肝理气,解毒缓中,使脾气充,肝气调,气滞消,瘀热散。高频组合主要可以分为:疏肝-补虚(如柴胡-白芍)、疏肝-利水渗湿(如柴胡-茵陈)、疏肝-活血化瘀(如柴胡-郁金)、补虚-补虚(如炙甘草-白芍)、疏肝-清热(如柴胡-赤芍),体现了补虚、清热、利湿的治法下,重用柴胡的用药特点。

3.3 关联规则分析

为了探寻本研究用药共性,参考已有报道[5],不同参数提取数据的预读与临床实际,将支持度个数设为88、122,置信度设为0.8。①支持度个数为88时(占总方药25%),以柴胡为中心,常与补虚药(炙甘草、白芍、白术)、清热药(赤芍、黄芩)、利水渗湿药(茯苓、茵陈)、活血化瘀药(郁金、丹参)、收涩药(五味子)等合用。②支持度个数为122时(占总方药35.7%),柴胡、茯苓、白芍、炙甘草、茵陈,是本研究最核心用药组合,可看作核心方。此方为《太平惠民和剂局方》“逍遥散”加减方,在逍遥散的基础上,去当归、薄荷、生姜,加茵陈。柴胡疏肝理气;茯苓利水渗湿,健脾和胃;白芍养血柔肝;炙甘草益气解毒,调和诸药;茵陈蒿清热利湿。全方共奏疏肝健脾,清利湿热之功。适用于肝郁脾虚兼内生湿热者,暗合前文补虚、清热、利湿,注重肝脾同治的治法。由于本研究的处方来源很多没有记载明确剂量,为便于研究,综合药典剂量、本研究纳入的有剂量数据的临床报道,将比例定为柴胡、茯苓、白芍、炙甘草、茵陈1∶1∶1∶1∶1。

综上,根据数据挖掘,推测ATDILI的病因病机应为:痨病在先,化疗后药毒伤肝,病位主要在肝、脾,病久必累及肾。本虚标实,以药毒、湿热、气滞、血瘀为标,以肝、脾、肺、肾气血亏虚为本。ATDILI的治疗以补虚、清热、利湿为总原则,注重肝脾同治。以疏肝解郁,健脾养血,清利湿热为基本治法,兼顾活血化瘀、理气化痰、止咳平喘。

3.4 核心方药的药效验证筛选

斑马鱼产卵多、繁殖快、胚胎透明，与人类基因有87%同源性[6]。在毒性筛选中,斑马鱼与传统模型相比，既有相似的神经、血管、代谢系统,又有相似的活性代谢产物,并且实验周期短、成本低、用药量少,更符合伦理[7]。斑马鱼模型可以高效地对数据挖掘结果进行高通量筛选验证。斑马鱼适用于中药保肝研究已经得到反复验证[8],并广泛用于ATDILI研究[9-10]。斑马鱼受精卵16 hpf发育出肝细胞前体,50 hpf形成肝脏并易于识别,60～72 hpf肝脏生长到适当大小,故肝毒性筛选多采用3 dpf的斑马鱼作为评价模型[10]。综合有关文献[9,11]与预实验,本研究采用8 mmol·L-1INH给药72 hpe建立斑马鱼ATDILI模型,结果显示,柴胡、茯苓、白芍、茵陈、炙甘草、丹参、郁金、白术以及核心方随着给药浓度增加,ATDILI模型斑马鱼幼鱼的畸形率、死亡率均显著下降(P<0.05)。至高浓度时,畸形率、死亡率又有上升。形态学上各药物干预组均发育好于模型组。与模型组相比,待筛选药物组的斑马鱼肝脏荧光面积显著上升(P<0.01),荧光光密度显著增强(P<0.01)。本研究基于数据挖掘技术得到的核心方药,在斑马鱼模型上均显示出一定的保肝作用。且核心方组的畸形率、荧光面积均优于阳性药DG与各单味药,体现了核心方的保肝优势,其具备作为新药开发的潜力。而在单味中药的筛选中,茵陈、白芍、丹参、白术组畸形率、荧光面积均优于阳性药组,显示对ATDILI具有较强的保肝作用,下一步可以继续筛选这些单味中药中的活性单体保肝成分。数据挖掘具有低成本、高通量的优势,本研究的实验结果又在一定程度上验证了数据挖掘技术的可靠性与适用性。

本研究的ATDILI药效筛选模型也存在一定的局限:①斑马鱼在基因、生物学特征上与哺乳动物仍存在一定差异性,其不一定能够完全反映药物在人类体内代谢的真实情况。②ATDILI模型仅适用于筛选在培养基中溶解度较高的药物,本研究曾经试图建立INH-利福平联用ATDILI模型,但由于利福平溶解度低而失败,目前同类研究均存在这一不足[10]。因此笔者在未来的研究中会专注于:①使用经典的哺乳动物模型对斑马鱼模型筛选的核心方药药效进行验证[12-13]。②继续改进斑马鱼ATDILI模型。③纳入更多数据挖掘出的高频药物、药对、新方在斑马鱼ATDILI模型进行筛选验证。④结合中药化学技术与生物学技术,发掘核心方药的活性成分,同时探索作用机制。